盐碱水是指矿化度为1000~50000 mg/L的非海洋性咸水资源，具有离子成分复杂和类型多样等特点。我国的盐碱水主要类型有华北滨海复合型、西北硫酸盐型和东北碳酸盐型^[1]，造成其差别的离子成分主要是Cl⁻、${\rm{SO}}_4^{2{\rm{ - }}}$和${\rm{HCO}}_3^ - $。研究不同类型的盐胁迫对水生生物毒性及危害的差异对开发利用盐碱水域资源、有效拓展水产养殖空间有重要意义。对小麦(Triticum aestivum)^[2]、高粱(Sorghum bicolor)^[3]和紫花苜蓿(Medicago sativa)^[4]等的研究表明，不同类型盐(NaCl、Na₂SO₄、Na₂CO₃和NaHCO₃)对植物的毒害存在差异，进而可以根据盐碱土类型选择培育和种植作物。而鱼类中类似的比较研究很少，鲫(Carassius auratus)的急性应激实验表明，NaHCO₃的毒性作用大于NaCl^[5]，杂交罗非鱼的转录组测序分析显示，与NaCl (25‰)相比，NaHCO₃ (4‰)胁迫后相关通路对病原体感染反应存在差异^[6]。上述研究涉及的盐的种类、鱼的种类、测定指标等都有限，不同盐胁迫对鱼类的毒害作用，以及鱼类对不同盐胁迫的生理响应、适应机制尚缺乏深入研究。

当所在环境渗透压发生变化时，鱼类主要通过鳃丝上皮细胞在离子转运交换体的运作下吸收和排出Na⁺、Cl⁻等离子，维持渗透压平衡^[7]。离子转运交换体有钠钾泵(Na⁺/K⁺-ATPase, NKA)，钠钾氯共转运蛋白(Na⁺/K⁺/2Cl⁻ cotransporter, NKCC)^[8]、${\rm{N}}{{\rm{a}}^{\rm{ + }}}{\rm{/HCO}}_3^ - $共转运体(Na⁺-coupled ${\rm{HCO}}_3^ - $ transporter, SLC4A4)^[9]、${\rm{C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}}{\rm{/HCO}}_3^ - $离子交换体(${\rm{C}}{{\rm{l}}^{\rm{ - }}}{\rm{/HCO}}_3^ - $ exchanger, SLC26A6)^[10]等。这些离子转运交换体在鱼类应答某一类盐胁迫过程中的作用机制比较清楚，但在应答不同盐胁迫过程中的作用机制差异尚无比较研究。环境胁迫对鱼类免疫系统的影响存在多样性，也可以用来衡量对鱼的毒害作用。盐胁迫会抑制鱼类免疫机能，如在高盐胁迫下施氏鲟(Acipenser schrenckii)幼鱼的非特异性免疫降低^[11]，青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)免疫相关基因表达下调^[12]，也有研究表明适当的盐胁迫会增进鱼类免疫功能，如尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)在1 g/L的碳酸盐水体中长期饲养，可以促进免疫防御，降低对嗜水气单胞菌感染的死亡率^[13]。前期转录组测序表明，趋化因子配体20 (C-C motif chemokine ligand 20, Ccl20)、死亡相关凋亡诱导蛋白激酶2 (death associated protein related apoptotic kinase 2, Dapk2)、γ-干扰素(interferon-gamma, γ-IFN)等免疫相关基因在盐胁迫鳜(Siniperca chuatsi)后表达变化(未发表)，但不同盐胁迫对鳜免疫机能的影响有待验证和比较。鳜属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)，鲈形目(Perciformes)，鮨科(Serranidae)，鳜亚科(Sinipercinae)，鳜属，自古就是我国淡水名贵鱼类。在盐碱水域中推广鳜养殖，能丰富盐碱水域鱼类多样性并提高盐碱水域经济效益。实验室前期研究发现鳜可以在103 mol/L NaCl或42 mmol/L Na₂SO₄的水体中长期生存，且鳜在pH 5~9范围具有一定耐受性^[14]。尽管如此，关于鳜盐碱耐受性的研究较少，也不够系统，更缺乏不同盐对鳜毒害作用差异的研究。

本研究依据我国盐碱水的主要类型，以中性盐(NaCl、Na₂SO₄)和碱性盐(NaHCO₃)配制胁迫环境溶液对鳜进行210 mmol/L Na⁺急性胁迫，并在胁迫后转入淡水恢复，分析鳜在3种盐胁迫下血清渗透压、血清离子(Na⁺、Cl⁻和K⁺)浓度以及鳃组织离子转运酶(NKA、NKCC、SLC4A4和SLC26A6)活性、免疫基因(Ccl20、γ-IFN和Dapk2)表达的变化，来阐述不同盐胁迫的毒害作用差异，为在不同盐碱地区筛选养殖鳜及生产布局提供理论基础，也为进一步研究鳜对NaCl、Na₂SO₄和NaHCO₃的耐受机制提供参考。

本研究所用鳜体重(5.8±1.3) g，均选自上海海洋大学滨海养殖基地，暂养于室内水泥池中。暂养期间，每天投活饵1次，投饵充足保证所有鳜可以吃到，养殖用水为曝气48 h以上的自来水，水温保持在(24.6±0.5) ℃, pH为7.5±0.1，溶解氧保持在5.0~6.0 mg/L。定时检查网箱水体充氧情况，待鱼完全适应环境后开展胁迫实验。实验前24 h停止喂食。

前期鳜[体重(1.76±0.31) g]盐胁迫实验表明，NaCl、Na₂SO₄和NaHCO₃胁迫96 h半致死浓度分别为LC₅₀=210 mmol/L、LC₅₀=81.6 mmol/L和LC₅₀=5.89 mmol/L。为比较不同盐对鳜的毒害作用，根据上述半致死浓度设定胁迫浓度。NaCl和NaHCO₃的半致死浓度相差较大，给胁迫浓度的设定带来很大困难。本研究中，在阳离子浓度(Na⁺=210 mmol/L)相等的情况下，设NaCl浓度210 mmol/L (pH 7.4)、Na₂SO₄浓度105 mmol/L (pH7.5)和NaHCO₃浓度210 mmol/L (pH 8.5)进行胁迫。实验在透明水箱(45 L)中进行。将实验鱼从淡水直接放入提前配好盐溶液的水箱内，每个箱内放30尾，每种盐设置3个重复。实验期间不投喂饵料，定期调整各水箱中的盐度至胁迫浓度，并保证氧气充足和温度恒定。NaCl组和Na₂SO₄组在胁迫后0、12、24 h和淡水恢复24 h、72 h采集实验样本，预实验中在210 mmol/L NaHCO₃胁迫后1 h内全部死亡，因此，NaHCO₃组胁迫后0、0.5 h和淡水恢复2 h、4 h (恢复时间约按胁迫时间的3倍以上)采集实验样本。取样时，每个平行重复组中随机取3尾鱼抽取血液和鳃组织用于测定渗透压、离子浓度、酶活性及基因表达，测定方法如下。

使用尾部静脉采血法抽取实验鱼0.5~1.0 mL血液，在1.5 mL离心管内静置12 h。分层后的血液离心(3000 r/min, 4 ℃, 5 min)后，提取上清液(血清)，使用渗透压仪(Logan, UT, USA)检测实验鱼血清渗透压。血清离子(Na⁺、K⁺和Cl⁻)浓度使用南京建成生物公司生产的离子检测试剂盒测定，使用Synergy H1酶标仪(Bio-tek, USA)检测样本吸光值。

抽血后的实验鱼，快速取出鳃组织。按质量和体积1∶9的比例加入生理盐水，高速冰水浴匀浆(2000 r/min)，组织匀浆液在Thermo高速冷冻离心机中离心5 min (12000 r/min)。吸取上清液，采用上海邦景生物公司的酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(Fish NKA、NKCC、SLC4A4、SLC26A6 ELISA Kit)，通过Synergy H1酶标仪读取450 nm波长的吸光值，计算各组织中NKA、NKCC、SLC4A4、SLC26A6 酶活性。

选取基因Ccl20、γ-IFN和Dapk2，使用β-actin作为内参基因。引物信息见表1。采用SYBR Green逆转录PCR试剂盒，按照说明书进行PCR检测。在CFX96 Real time PCR体系中进行PCR反应。PCR条件为50 ℃持续2 min, 95 ℃持续10 min，然后在95 ℃持续15 s和60 ℃持续1 min的40个循环。采用2^−ΔΔCt法计算基因相对表达量。

表1

表1 　用于验证实验的qRT-PCR引物 Tab. 1 　Primers for qRT-PCR validation of experimental genes 基因gene 引物序列(5ʹ‒3ʹ) sequence of primers (5ʹ‒3ʹ) Ccl20 F: TGGCAATCAGCAAAGTGTGTC R: CCCTGGAATGTGGAAGATAACA γ-IFN F: CGAGGGCAGTGGTCTGTCTA R: CACCATCTTTGCCTCGGTTT Dapk2 F: TTGGTGAAGAGTTGGGAAGTGG R: TGCTCTGCCGTTTCTTGATGA β-actin F: GTGCGTGACATCAAGGAGAAG R: GGAAGGAAGGCTGGAAGAGG

表1 　用于验证实验的qRT-PCR引物 Tab. 1 　Primers for qRT-PCR validation of experimental genes

综合生物标志物响应指数(integrated biomarker response index, IBR)由法国海洋开发研究院的Beliaeff等^[15]于2002年建立，用于海洋环境质量评价。选择生物标志物，包括鳃组织NKA、NKCC、SLC4A4和SLC26A6酶活性，取不同盐胁迫下酶活性的峰值。对鳃组织不同酶活性数据进行均一化，并将其绘制为星状图中的向量。IBR值是通过连接生物标志物的端点形成的多边形的面积，并且可以根据如下公式计算：

式中，S_i和S_i+1表示均一化后的相邻生物标志物值，n表示生物标志物的数量。

实验数据利用SPSS 26.0统计软件分析，单因素方差分析进行显著性检验，Duncan多重比较检测各测量指标的差异，以P<0.05为差异显著。使用Graphpad Prism 8进行绘图。

NaCl和Na₂SO₄胁迫24 h过程中实验鱼并没有出现过激的行为，在NaHCO₃胁迫的0.5 h内实验鱼出现狂游乱窜，鳃部不断扩张，体表分泌大量黏液，实验液出现持续的泡沫。在淡水恢复阶段，经NaCl和Na₂SO₄胁迫后实验鱼状态无明显变化，NaHCO₃胁迫后实验鱼处于濒死状态。

NaCl胁迫后鳜血清渗透压在胁迫24 h内持续上升(P<0.05)，在淡水恢复阶段鳜血清渗透压出现下降趋势，淡水恢复72 h血清渗透压下降趋势明显但仍高于胁迫初始阶段(图1a)。Na₂SO₄胁迫后，鳜血清渗透压胁迫12 h内持续下降(P<0.05)，之后又出现血清渗透压上升趋势(P<0.05)，胁迫24 h内持续上升；淡水恢复阶段，血清渗透压在恢复24 h恢复到胁迫起始水平，在持续恢复72 h内血清渗透压出现了轻微上升(图1b)。NaHCO₃胁迫后，0.5 h内渗透压未出现明显的上升趋势，但是在淡水恢复阶段渗透压下降严重(图1c)(P<0.05)。

在NaCl胁迫12 h时Na⁺含量显著上升(P<0.05)，持续胁迫24 h Na⁺含量持续上升，在进行淡水恢复24 h、72 h后Na⁺含量呈现下降趋势，且高于胁迫初始阶段；血清Cl⁻含量在胁迫阶段少量上升，淡水恢复阶段又逐渐恢复至胁迫初始阶段；血清K⁺含量胁迫阶段并未有显著变化，而在恢复阶段出现上升趋势(图2a)。Na₂SO₄胁迫后，血清Na⁺在12 h显著上升(P<0.05)，随后12~24 h之间上升缓慢，在恢复阶段24 h内显著下降(P<0.05)，最终恢复至胁迫初始阶段；血清Cl⁻含量在胁迫和恢复过程中并没有显著的变化；血清K⁺浓度在胁迫12 h时并未变化，12~24 h有上升趋势，在淡水恢复阶段血清K⁺浓度在恢复72 h内有上升趋势，但上升趋势不明显(图2b)。NaHCO₃胁迫后，0.5 h内血清Na⁺含量有上升趋势，随着恢复阶段的开始，恢复2 h和4 h后血清K⁺浓度显著下降(P<0.05)，最终低于胁迫初始水平；血清Cl⁻浓度在胁迫0.5 h并无显著变化，胁迫结束后，在恢复阶段中Cl⁻浓度2~4 h内显著上升，高于胁迫初始阶段；血清K⁺浓度，在胁迫0.5 h内上升不明显，淡水恢复阶段K⁺含量无明显变化，恢复结束后血清K⁺含量略高于胁迫初始水平(图2c)。

图1

图1 　不同盐胁迫后鳜血清渗透压变化FW表示淡水恢复阶段；不同字母表示差异有统计学意义（P<0.05）. Fig. 1 　Changes in serum osmolarity of Siniperca chuatsi upder different salt stressesFW represents freshwater recover. Different letters indicates statistically significant differences (P<0.05).

不同盐胁迫对鳃组织NKA酶活性的影响见图3。NaCl胁迫24 h过程中鳃组织NKA酶活性持续显著上升(P<0.05)，当进入淡水恢复后NKA酶活性逐渐下降，最终降至胁迫起始阶段。Na₂SO₄胁迫12 h时，鳃组织NKA酶活性显著上升(P<0.05)，胁迫12~24 h上升缓慢，淡水恢复后鳃组织酶活性恢复至胁迫初始阶段。NaHCO₃胁迫0.5 h时NKA酶活性显著上升(P<0.05)，进入淡水恢复过程中酶活性持续降低，最终低于胁迫起始水平。

不同盐胁迫对鳃组织NKCC酶活性的影响见图4。NaCl胁迫12 h时鳃组织NKCC酶活性最低(P<0.05)，随着胁迫时间的继续，胁迫24 h时鳃组织NKCC酶活性呈现上升的趋势(P<0.05)；淡水恢复阶段鳃组织NKCC酶活性无明显变化。Na₂SO₄胁迫12 h内鳃组织NKCC酶活性显著下降(P<0.05)，随着胁迫继续鳃组织NKCC酶活性稳定；淡水恢复阶段鳃组织NKCC酶活性有上升的趋势，恢复结束后鳃组织NKCC酶活性仍低于胁迫起始水平。碳酸钠胁迫0.5 h时鳃组织NKCC酶活性有下降的趋势，放入淡水后鳃组织NKCC酶活性仍显著下降(P<0.05)。

图2

图2 　不同盐胁迫后鳜血清离子浓度变化FW表示淡水恢复阶段；不同字母表示不同时间差异显著（P<0.05）. Fig. 2 　Changes of serum ion concentrations of under different salt stressesFW represents freshwater recovery. Different letters indicates significant differences among different time (P<0.05).

图3

图3 　不同盐胁迫后鳜鳃组织Na+/K+-ATP酶(NKA)活性变化FW表示淡水恢复阶段；不同字母表示差异有统计学意义（P<0.05）. Fig. 3 　Changes of Na+/K+-ATPase (NKA) activity in Siniperca chuatsi gill upder different salt stressesFW represents freshwater recovery. Different letters indicates statistically significant differences (P<0.05).

图4

图4 　不同盐胁迫后鳜鳃组织Na+/K+/2Cl−协同转运蛋白(NKCC) 酶活性变化FW表示淡水恢复阶段；不同字母表示差异有统计学意义（P<0.05）. Fig. 4 　Changes of Na+/K+/2Cl− cotransporter (NKCC) enzyme activity in Siniperca chuatsi gill under different salt stressesFW represents freshwater recovery. Different letters indicates statistically significant differences (P<0.05).

不同盐胁迫对鳃组织SLC4A4酶活性的影响见图5。NaCl胁迫24 h鳃组织SLC4A4酶活性下降不明显，在淡水恢复24 h时鳃组织酶活性有上升趋势，淡水恢复结束后鳃组织SLC4A4酶活性与胁迫起始阶段无显著变化。Na₂SO₄胁迫12 h内鳃组织SLC4A4酶活性有上升的趋势，随着胁迫的继续，胁迫24 h鳃组织SLC4A4酶活性趋势稳定；淡水恢复24 h时鳃组织SLC4A4酶活性升高，恢复结束后鳃组织SLC4A4酶活性下降至胁迫起始阶段。NaHCO₃胁迫0.5 h时鳃组织SLC4A4酶活性显著下降(P<0.05)，进入淡水恢复2 h后鳃组织SLC4A4酶活性恢复至胁迫起始阶段。

不同盐胁迫对鳃组织SLC26A6酶活性的影响见图6。NaCl胁迫后，鳃组织SLC26A6酶活性下降(P<0.05)，经过淡水恢复后SLC26A6酶活性停止了下降趋势，但仍保持低于胁迫起始水平(P<0.05)。Na₂SO₄胁迫后，鳃组织SLC26A6酶活性12 h显著下降(P<0.05)，在淡水恢复阶段鳃组织SLC26A6酶活性无显著变化，恢复结束后酶活性低于胁迫初始阶段。NaHCO₃胁迫0.5 h后，鳃组织SLC26A6酶活性下降，随着淡水恢复的开始酶活性始终下降(P<0.05)。

不同盐胁迫后鳃组织免疫基因表达见图7。Ccl20在NaCl和Na₂SO₄胁迫24 h后表达量显著升高(P<0.05)，而在NaHCO₃胁迫过程中Ccl20表达量下降。Dapk2表达量在NaCl和NaHCO₃胁迫后显著下降(P<0.05), Na₂SO₄胁迫后Dapk2表达量尽管也下降，但并不显著。γ-IFN表达量在NaCl胁迫24 h后显著下降(P<0.05), Na₂SO₄和NaHCO₃胁迫后表达量下降不显著。

图5

图5 　不同盐胁迫后鳜鳃组织SLC4A4酶活性变化FW表示淡水恢复阶段；不同字母表示差异有统计学意义（P<0.05）. Fig. 5 　Changes of SLC4A4 enzyme activity in Siniperca chuatsi gill under different salt stressesFW represents freshwater recovery. Different letters indicate statistically significant differences (P<0.05).

图6

图6 　不同盐胁迫对后鳜鳃组织SLC26A6酶活性变化FW表示淡水恢复阶段；不同字母表示差异有统计学意义（P<0.05）. Fig. 6 　Changes of SLC26A6 enzyme activity in Siniperca chuatsi gill under different salt stressesFW represents freshwater recovery. Different letters indicate statistically significant differences (P<0.05).

鳃组织不同酶活性综合生物标志物响应指数分析结果见图8。NaCl、Na₂SO₄和NaHCO₃的IBR值分别为3.03、10.39和0.95，其中Na₂SO₄对4种酶的综合响应最大，NaHCO₃对4种酶的综合响应最小。

当淡水鱼转入高渗环境中，鱼体初期会出现脱水现象，当适应环境后，鱼体渗透压和离子浓度会趋于稳定，但过高的环境压力会引发病变甚至死亡^[16]。在本研究中，不同盐胁迫引起鳜血清渗透压的变化存在差异，在NaCl胁迫及淡水恢复过程中，渗透压先升高后降低，最终表现出接近初始水平的趋势；在Na₂SO₄胁迫及淡水恢复过程中，渗透压变化有两次波动，大致为先下降后上升，最终稳定在初始水平；在NaHCO₃胁迫及淡水恢复过程中，渗透压略有升高后迅速下降，最终显著低于初始水平。结果表明，在210 mmol/L Na⁺胁迫下，NaHCO₃胁迫对鳜渗透压的影响强于NaCl和Na₂SO₄。此外，NaCl和Na₂SO₄胁迫组中实验鱼并没有出现过激的行为，而NaHCO₃胁迫组中实验鱼出现剧烈的应激反应，如狂游乱窜并伴随着鳃部扩张，体表分泌大量黏液，也说明NaHCO₃对鳜的毒害作用强于NaCl和Na₂SO₄。其中可能的原因是，NaCl和Na₂SO₄是中性盐，水体pH在7.5左右，NaHCO₃是碱性盐，水体pH较高(8.5)，增加了其对水生生物的毒性，如pH升高会使得鱼体内代谢的氨氮(NH₃)不能有效地转换为NH₄⁺的形式排出体外，造成氨中毒^[17]。此外，${\rm{HCO}}_3^ - $也会引起淡水鱼类体表溃烂、烂鳃以及瞎眼等。

在由淡水转入海水(盐度35‰, NaCl浓度 >500 mmol/L)及淡水恢复过程中，广盐性鱼类如莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)^[18]、黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)^[19]、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)^[18]、茉莉花鳉(Poecilia latipinna)^[20]等的血清渗透压先上升，然后短期内显著下降至胁迫初始水平，与此不同，在本研究的NaCl胁迫及淡水恢复过程中，鳜血清渗透压虽然显著下降但仍高于胁迫初始水平，推测鳜对渗透压改变的适应能力弱于广盐性鱼。本研究中，在NaCl与Na₂SO₄胁迫过程中，鳜血清Na⁺浓度随着胁迫时间增加而上升，转入淡水恢复后Na⁺浓度降低至胁迫初始水平，在NaHCO₃胁迫过程中，Na⁺浓度上升，转入淡水恢复后Na⁺浓度仍然上升，而在不同盐胁迫及淡水恢复过程中，鳜血清Cl⁻、K⁺浓度并无显著的变化。由此表明在210 mmol/L Na⁺胁迫下，Na⁺是造成鳜血清离子浓度变化的主要离子，这一点和其他鱼类在盐胁迫下血清中Na⁺和Cl⁻同时发生显著变化不同^[21]。

图7

图7 　不同盐胁迫后鳜鳃组织Ccl20, Dapk2和γ-IFN基因表达FW表示淡水恢复阶段；不同字母表示差异有统计学意义（P<0.05）. Fig. 7 　Expression of Ccl20, Dapk2, and γ-IFN genes in Siniperca chuatsi gill under different saline stressesFW represents freshwater recovery. Different letters indicate statistically significant differences (P<0.05).

图8

图8 　不同盐胁迫下鳜鳃组织综合生物标志物响应评价a. IBR指数的星状图；b. IBR柱状图. Fig. 8 　Evaluation of integrated biomarker response of Siniperca chuatsi gill tissue under different salt stressesa. Star plot of IBR index; b. IBR histogram.

在盐胁迫过程中鱼类的NKA、NKCC、SLC4A4和SLC26A6活性通常有升高的趋势^[22-24]。NKA在胁迫过程中不仅可以维持细胞内外的离子平衡，也为细胞各种活动提供能量，这些能量可以维持NKCC、SLC4A4和SLC26A6正常工作。本实验中，鳜鳃组织NKA酶活性在不同盐胁迫及淡水恢复过程中均显著先上升后下降，这与广盐性鱼类类似；NKCC和SLC26A6酶活性在NaCl和Na₂SO₄胁迫后显著下降，在转入淡水阶段有一定恢复，但仍处于较低的水平。NKCC和SLC26A6酶活性在NaHCO₃胁迫后开始下降，在转入淡水阶段后显著下降。SLC4A4酶活在NaCl和Na₂SO₄胁迫后无显著变化，在NaHCO₃胁迫后显著下调。由此推测210 mmol/L Na⁺胁迫对鱼体产生较强的毒害，会抑制部分离子转运酶表达。进一步对星状图每个站位上不同生物标志物(NKA、NKCC、SLC4A4和SLC26A6)的测定结果进行赋值，计算星状图的面积得出不同盐胁迫后的IBR值，可以更好地区分不同盐胁迫的差异影响。本研究中NaHCO₃胁迫组的IBR值最小，表明酶的活性较低，即NaHCO₃胁迫对离子转运酶活性的抑制作用明显。同为中性盐的Na₂SO₄ 胁迫组IBR值显著高于NaCl胁迫组，推测和鱼类缺乏吸收或调节硫酸盐的主动机制有关，有待深入研究。

Ccl20是一种重要的免疫调节因子，有重要的免疫调节作用，是先天性免疫和适应性免疫之间的桥梁^[25]。Dapk2是一种钙/钙蛋白调节的Ser/Thr激酶，可以调节自噬细胞死亡、促进炎症期间的细胞募集^[26-27]。γ-IFN是参与辅助性T淋巴细胞1 (Th1)免疫反应中的关键细胞因子之一。虹鳟(Oncorhynchus mykiss) Ccl20基因的表达分析表明，Ccl20在黏膜免疫中起重要作用^[28]。徐等^[29]发现比目鱼(Paralichthys olivaceus)感染迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)后Dapk表达上调。接种γ-IFN的大菱鲆(Scophthalmus maximus)与未接种的鱼相比，在细菌感染后，γ-IFN和促炎症细胞因子的表达增加^[30]。免疫反应是鱼类应对环境变化的重要机制。本研究中，在3种盐胁迫后Dapk2、γ-IFN表达均下调，说明3种盐胁迫使得鳜鳃组织炎症的调节受到抑制，也在一定程度上降低了免疫机能。在NaCl、Na₂SO₄胁迫24 h时Ccl20表达量最高，说明机体免疫反应正在进行，Ccl20指引免疫细胞到达组织各个位置，而在NaHCO₃胁迫中，Ccl20表达始终受到了抑制，也反映了NaCl、Na₂SO₄胁迫与NaHCO₃胁迫的差异。

本研究首次报道了不同盐(NaCl、Na₂SO₄和NaHCO₃)对鳜的毒害作用，但实验中也存在不足之处：210 mmol/L Na⁺相对于NaHCO₃胁迫的半致死浓度而言浓度较高，预实验中在210 mmol/L NaHCO₃胁迫后1 h内全部死亡，也体现了该浓度胁迫的生物学意义，即造成严重的损伤。不同规格的鱼对环境的耐受性也存在差异，今后应补充低浓度胁迫和不同规格鱼的实验，以全面评价不同盐胁迫对鳜的毒性影响。实际的盐碱水域中离子成分复杂，实验中以单一盐胁迫也不能准确模拟自然盐碱水体，需进一步考量混合离子成分的作用。

在210 mmol/L Na⁺胁迫下，3种盐均对鳜产生明显的毒害作用。NaHCO₃胁迫引起鳜应激反应强烈，严重抑制免疫机能，降低炎症的调节功能，且对大部分离子转运酶(NKCC、SLC4A4和SLC26A6)活性的抑制作用明显，即离子转运酶活性的综合响应最小，导致血清渗透压在转入淡水后不能恢复。NaCl和Na₂SO₄胁迫对鳜毒害影响弱于NaHCO₃胁迫，免疫机能尚未完全抑制，可通过部分离子转运酶活性(NKA和SLC4A4)来响应环境变化，从而使其血清渗透压能接近初始水平，其中Na₂SO₄胁迫下离子转运酶活性的综合响应最大。