稻渔综合种养是一种从传统稻田养殖发展而来的环保农业模式，具有环境可持续性和较高的生态效益^[1]。稻田生态系统具有一定的自我调节功能，能够为鱼类提供稳定安全的生存环境及食物来源，同时鱼类活动可减少稻田病虫草害发生并提供有机肥料。稻渔综合种养实现了提质增效以及生态环保的双重效益^[2]。2021年，我国稻渔综合种养面积达264.4万hm²，水产品产量约3.56×10⁹ kg，占淡水养殖产量的11%以上。现有研究表明，在稻田养殖环境下，瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)肌肉风味物质含量更丰富，肉质更鲜美^[3]；稻田养殖建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)、金边鲤(Cyprinus carpio var. Jinbian)肌肉蛋白质含量高于池塘养殖，且肌肉弹性、咀嚼性与口感更佳^[4]；稻田禾花鲤(Procypris merus)肌肉多不饱和脂肪酸(尤其是EPA+DHA)含量较池塘养殖的更高^[5]；稻田瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var. color)肌肉必需氨基酸、矿物质元素等含量更丰富，氨基酸与脂肪酸的组成也更加合理，表明其具有更佳的营养品质^[6]。

养殖密度是影响鱼类生长的重要因子^[7]，过高的养殖密度可能导致水体富营养和水质恶化，引起对养殖环境与鱼类生理功能不利的变化^[8]。高养殖密度也可导致养殖鱼类对于饲料及生存区域的争夺^[9]，降低生长性能、免疫功能^[10]，增加疾病暴发风险。因此，优化养殖密度可保证养殖鱼类的正常生长，有效提高鱼类产量、品质，增加养殖系统效益并减少对环境的污染。

大口黑鲈(Micropterus salmoides)是我国重要的淡水养殖肉食性鱼类，2020年其总产量约为62万t^[11]。大口黑鲈养殖模式包括池塘、网箱、工厂化循环水等，其中池塘养殖为最主要的养殖模式^[12]。不同养殖模式中，大口黑鲈的适宜养殖密度存在较大的差异，如在池塘养殖中为4~6 kg/m³，网箱养殖中为1.5 kg/m³，池塘工程化循环水养殖模式中为0.2~0.4 kg/m³ (养殖120 d)，室内循环水养殖模式中为2.8 kg/m³ (养殖56 d)。研究已表明，在池塘、循环水养殖模式下养殖密度过高时会导致大口黑鲈生长及免疫性能降低，引起氧化损伤，提高养殖成本^[13-16]。前期的研究显示，在稻渔综合种养系统中，大口黑鲈养殖密度不宜超过375 g/m^3[17]，然而在该系统中高养殖密度是否影响大口黑鲈肌肉组织抗氧化状态、营养组成和代谢功能尚未可知。本研究基于代谢组和转录组学分析，结合抗氧化状态以及氨基酸和脂肪酸组成，探究不同养殖密度下大口黑鲈肌肉代谢物、基因以及相关信号通路的变化，在分子水平解析高密度养殖对大口黑鲈肌肉营养品质的影响，并阐明其应对不利养殖环境的响应机制，为优化稻-鲈共作养殖模式提供理论依据。

本研究在江苏省靖江市中国水产科学研究院淡水渔业研究中心养殖基地进行。实验设计6个稻-鲈共作系统，每个系统由种植区和养殖区(环沟)组成。种植区面积为1624 m² (长58 m，宽28 m)，养殖区面积176 m² (宽2 m，深约0.8 m)，稻田水深10~20 cm。养殖系统示意图如图1。系统中水稻种植品种为南粳5055，于2021年6月中旬插秧，11月上旬收割。水稻播种40 d后，施肥并喷洒除草除虫农药1次；60 d后施穗肥一次。

实验开始于7月30日，大口黑鲈购于安徽张林渔业有限公司(皖鲈1号新品系)。挑选规格相近，健康无伤的大口黑鲈进行养殖实验，大口黑鲈初始体重为(40.63±0.13) g，体长(11.64±0.51) cm。设置初始养殖密度：低密度组(L, 40 g/m³, 120尾/系统)和高密度组(H, 120 g/m³, 360尾/系统)，每个密度设3个重复。实验期间投喂大口黑鲈商品饲料(中国常州海大生物饲料有限公司，粗蛋白≥47.0%、粗脂肪≥5.0%、粗灰分≥18.0%、粗纤维≥3.0%、赖氨酸≥2.7%)，每日投喂2次(8时和18时各1次)，日投饲量为鱼体重2%~3%，并根据鱼体重调整。养殖期间保持稻田20 cm左右水位高度，不定期进行补水，水体pH和溶氧为(7.25± 0.32)和(5.8±0.51) mg/L，总氨氮低于0.5 mg/L，亚硝酸盐氮不超过0.1 mg/L。养殖周期为90 d，实验于10月30日结束，养殖期间不增氧、不施肥、不撒农药。养殖末期，高密度组存活率(76.7%)低于低密度组(86.4%)，增重率(429.5%)显著低于低密度组(582.7%)，表明高养殖密度会抑制稻田养殖大口黑鲈生长^[17]。

图1

图1 　稻-鲈共作系统示意图 Fig. 1 　Schematic diagram of rice-bass ecosystems

养殖实验结束后，每组随机挑选36尾鱼(每个重复12尾鱼)，使用MS-222 (100 mg/L)进行麻醉后采集背部白肌组织，测定抗氧化状态、氨基酸和脂肪组成，以及进行转录组和代谢组测序。抗氧化状态分析中，4条鱼肌肉组织混合成一个样本，氨基酸和脂肪组成测定、转录组和代谢组测序中12条鱼肌肉组织混合为一个样本。

取0.1 g肌肉组织，加入0.9 mL生理盐水(0.86%)，制成10%的肌肉匀浆。抗氧化指标主要包括总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。T-AOC、SOD和GSH试剂盒购于南京建成生物工程研究所；MDA和CAT购于上海碧云天生物技术有限公司；GSH-Px选自苏州格锐思生物科技有限公司。所有指标按照试剂盒说明书进行测定。

氨基酸含量检测采用酸水解法对肌肉样品处理，取样品加6 mol/L盐酸于110 ℃水解22 h，过滤定容水解液后取1.0 mL滤液减压干燥后过滤。游离氨基酸含量检测时，取样品加20 mmol/L盐酸溶解定容，活化前处理小柱后加样品2.5 mL及20 mmol/L的盐酸1.5 mL，过柱后用20 mmol/L盐酸定容后过滤。使用日本日立的LA8080氨基酸自动分析仪进行测定(GB5009.124-2016)，波长为570 nm和440 nm，进样体积20 μL，色谱柱为磺酸型阳离子树脂分离柱，反应温度135 ℃。脂肪酸含量使用Agilent7890A气相色谱仪检测(GB5009.168-2016)，样品经水解提取和甲酯化处理后进行检测。气相色谱仪主要参数：色谱柱为HP-88 (100 m×0.25 mm× 0.20 μm)；升温程序为100 ℃保持13 min，以10 ℃/min速率升温至180 ℃保持6 min，以 1.0 ℃/min速率升温192 ℃保持9 min，以3.0 ℃/min速率升温230 ℃保持2 min；载气为N₂，流速1.0 mL/min，分流比40∶1。氨基酸、脂肪酸含量以鲜重计。

精确称重100 mg样本加入0.5 mL的80%甲醇水溶液，于4 ℃、15000 r/min离心20 min，取上清液稀释至甲醇含量为53%后同等条件再次离心，移取上清液进行LC-MS代谢组测序。所有实验样本提取液等体积混合制备质控(quality control, QC)样本用于系统稳定性评价与提高数据质量。色谱条件：色谱柱为Hypesil Gold column (C18)；流速为0.2 mL/min，柱温为40 ℃；代谢物采用梯度洗脱。质谱条件：喷雾电压3.5 kV，鞘气流速35 psi，辅助气流速10 L/min，离子传输管温度320 ℃，离子导入射频电平60，辅助气加热器温度350 ℃，扫描范围M/Z为100-1500。

将采集的数据导入Compound Discoverer 3.1中，进行峰对齐、峰提取、面积定量、数据库(mzCloud, mzVault, Masslist)比对等处理，得到代谢物定性定量结果。对于代谢物采用数据库(KEGG、HMDB、LIPIDMaps)进行注释。用metaX对数据进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，进而得到每个代谢物的VIP值。基于t检验计算各代谢物组间显著性(P-value)及差异倍数(fold change, FC)。差异代谢物筛选的默认标准为VIP>1, P<0.05且FC≥1.2或FC≤0.83。使用 KEGG数据库进行代谢通路富集相关分析。本部分实验及数据分析由北京诺禾致源科技股份有限公司协助完成。

使用TRIzol试剂提取肌肉中的总RNA，检验纯度、浓度与完整性，使用Oligo (dT)磁珠富集具polyA的真核mRNA，将其片段化后在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA一链，随后降解RNA链，在DNA polymerase I体系下以dNTPs为原料合成cDNA二链。纯化双链修复处理后用AMPure XP beads筛选cDNA进行PCR扩增并再次纯化获得文库，进行转录组测序。利用fastp过滤下机原始数据(raw data)获得有效数据(clean data)，利用HISAT2软件进行参考基因组序列比对，用Stringtie软件重构转录本后找出新基因并统计基因类型。使用RSEM软件计算样本基因表达量，以FPKM表示。使用DESeq2软件以差异倍数|log₂FC|≥2且P<0.05为标准筛选组间差异表达基因，并将其与GO和KEGG数据库进行比对，进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。本部分实验及数据处理由广州基迪奥生物科技有限公司协助完成。

为了验证转录组测序分析结果的可靠性，随机挑选了6个差异基因进行qRT-PCR验证。使用宝日医生物技术(北京)有限公司的RNAiso Plus试剂提取总RNA，以primeScript™ RT试剂盒(TaKaRa, RR047A)合成cDNA，使用qPCR试剂盒(TaKaRa, RR820A)检测相关基因的表达。以β-actin作为内参基因(表1)，采用2^–△△Cq法计算目标基因相对表达。

表1

表1 　qRT-PCR引物 Tab. 1 　Primers used for qRT-PCR analysis 基因gene 正向引物(5ʹ‒3ʹ) forward primer sequence (5ʹ‒3ʹ) 反向引物(5ʹ‒3ʹ) reverse primer sequence (5ʹ‒3ʹ) mylpf GCTGATCCCGAGGACGTTAT CAAGGGGGAGTGAGTAGATGG alas2 GGGAGAAATCCTACTTCGGCA TATGAAAGTGACCGGTGTGC esrrb AAGGTGCCCATGCACAAACT GGGTCTGCCTCTCCTGAGTA hba GCCCACGGAAAGAAGGTCAT ATGGTCAAGAGCGGCAGAC cebpb GCATGGAGTACCGACAGAGG AGGTATGTCTCCAAAAAGCTCAGT cry1 GCCGACTCTACCACGAGTTT TCTGATGTGGATTCGGACGG β-actin AAAGGGAAATCGTGCGTGAC AAGGAAGGCTGGAAGAGGG

表1 　qRT-PCR引物 Tab. 1 　Primers used for qRT-PCR analysis

原始数据经Excel 软件初步整理，使用SPSS 27.0软件进行分析并将结果表示为平均值±标准误($\bar x \pm {\rm{SE}}$)。通过独立样本t检验分析不同养殖密度之间的差异，P<0.05为差异显著，具有统计学意义。通过Pearson检验对RNA-seq数据和qPCR数据进行相关性分析，P<0.05为差异显著。使用Origin 2019和GraphPad Prism 8.0软件绘图。

90 d时，H组肌肉T-AOC显著低于L组(P<0.05)，但SOD、CAT、GSH-Px活性以及MDA、GSH含量在不同密度组中无显著差异(图2)。

图2

图2 　养殖密度对大口黑鲈肌肉抗氧化能力的影响L：低密度组（40 g/m3）; H：高密度组（120 g/m3）; *表示组间差异显著（P<0.05）. Fig. 2 　Effect of stocking density on antioxidant capacity of Micropterus salmoides muscleL: low density (40 g/m3); H: high density (120 g/m3); * indicates significant difference between different groups (P<0.05).

大口黑鲈肌肉中共检测出17种水解氨基酸，包括7种必需氨基酸(EAA)、2种半必需氨基酸(HEAA)和8种非必需氨基酸(NEAA)；以及13种游离氨基酸，包括2种鲜味氨基酸(UAA)、6种甜味氨基酸(SAA)和4种苦味氨基酸(BAA)等。水解氨基酸中缬氨酸含量在H组显著下降(P<0.05)。游离氨基酸中丙氨酸、组氨酸在H组含量显著下降(P<0.05)，甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸含量与∑UAA显著增加(P<0.05)。两个密度组中∑SAA>∑BAA> ∑UAA (表2)。

表3 结果显示，大口黑鲈肌肉检测到15种水解脂肪酸，包括3种饱和脂肪酸(SFA)、5种单不饱和脂肪酸(MUFA)以及7种多不饱和脂肪酸(PUFA)，且各组∑PUFA>∑MUFA>∑SFA。与L组相比，H组肉豆蔻酸(C14∶0)、棕榈酸(C16∶0)、棕榈油酸(C16∶1)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1n9c)、亚油酸(C18∶2n6c)、α-亚麻酸(C18∶3n3)、花生烯酸(C20∶1)和二十碳二烯酸(C20∶2)含量以及∑SFA、∑MUFA、∑PUFA、∑n-6 PUFA显著增加(P<0.05)，而n-3 PUFA/n-6 PUFA比值降低。

结果显示，L组和H组样本组间分离清晰，表明两组存在差异性(图3a)，同时经响应排序检验证明本批样本未出现“过拟合”(R²>Q²且Q²回归线与Y轴截距<0，图3b)，表示此模型可用于后续分析。大口黑鲈肌肉样本中共检出494个代谢物，高养殖密度引起186个差异代谢物，其中136个上调，50个下调(图3c)。

表2

表2 　不同养殖密度下大口黑鲈肌肉氨基酸含量及组成 Tab. 2 　Content and composition of amino acids in muscle of Micropterus salmoides at different stocking densities n=3; $\bar x \pm {\rm{SE}}$; g/100 g 水解氨基酸 hydrolyzed amino acid 低密度组 low density 高密度组 high density 游离氨基酸 free amino acid 低密度组 low density 高密度组 high density 谷氨酸Glu 2.64±0.03 2.56±0.04 天冬氨酸Asp△ 0.01±0.002 0.03±0.006* 丙氨酸Ala 1.04±0.01 1.06±0.01 谷氨酸Glu△ 0.16±0.003 0.19±0.003* 甘氨酸Gly 0.84±0.01 0.91±0.02 甘氨酸Gly△△ 0.65±0.003 0.69±0.009* 天冬氨酸Asp 1.80±0.01 1.75±0.03 丙氨酸Ala△△ 0.38±0.003 0.34±0.006* 蛋氨酸Met# 0.32±0.06 0.23±0.08 丝氨酸Ser△△ 0.03±0.003 0.03±0.008 异亮氨酸Ile# 0.81±0.01 0.77±0.02 脯氨酸Pro△△ 0.84±0.054 0.75±0.003 赖氨酸Lys# 1.63±0.02 1.60±0.03 赖氨酸Lys△△ 0.32±0.060 0.22±0.068 亮氨酸Leu# 1.49±0.04 1.38±0.03 苏氨酸Thr△△ 0.33±0.015 0.24±0.091 缬氨酸Val# 0.94±0.01 0.88±0.02* 缬氨酸Val& 0.05±0.005 0.06±0.009 苯丙氨酸Phe# 0.80±0.02 0.76±0.01 胱氨酸Cys 0.01 0.02±0.012 苏氨酸Thr# 0.81±0.01 0.80±0.01 异亮氨酸Ile& 0.02 0.02±0.002 丝氨酸Ser 0.65 0.64±0.01 亮氨酸Leu& 0.07±0.014 0.11±0.011 脯氨酸Pro 0.59±0.02 0.64±0.01 组氨酸His& 0.84±0.023 0.65±0.012* 胱氨酸Cys 0.04±0.01 0.04±0.01 氨基酸总量∑TAA 3.70±0.164 3.33±0.116 酪氨酸Tyr 0.51±0.04 0.43±0.02 鲜味氨基酸∑UAA 0.17±0.003 0.21±0.008* 精氨酸Arg## 0.94±0.01 0.93±0.01 甜味氨基酸∑SAA 2.56±0.128 2.26±0.157 组氨酸His## 0.46±0.02 0.45±0.01 苦味氨基酸∑BAA 0.97±0.041 0.84±0.028 氨基酸总量∑TAA 16.31±0.19 15.83±0.29   必需氨基酸∑EAA 6.81±0.12 6.42±0.18   半必需氨基酸∑HEAA 1.40±0.01 1.37±0.01   非必需氨基酸∑NEAA 8.10±0.08 8.03±0.10   EAA/TAA 41.75% 40.56%   EAA/NEAA 84.07% 79.95%   HEAA/TAA 8.58% 8.72%   NEAA/TAA 49.66% 50.73%       注：#必需氨基酸；##半必需氨基酸；△鲜味氨基酸；△△甜味氨基酸；&苦味氨基酸；*表示组间差异显著(P<0.05). Note: # indicates essential amino acid; ## indicates half essential amino acid; △indicates umami amino acids; △△indicates sweetness amino acid; & indicates bitterness amino acid; * indicates significant difference between different densities (P<0.05).

表2 　不同养殖密度下大口黑鲈肌肉氨基酸含量及组成 Tab. 2 　Content and composition of amino acids in muscle of Micropterus salmoides at different stocking densities n=3; $\bar x \pm {\rm{SE}}$; g/100 g

表3

表3 　不同养殖密度下大口黑鲈肌肉脂肪酸含量及组成 Tab. 3 　Content and composition of fatty acids in muscle of Micropterus salmoides at different stocking densities n=3; $\bar x \pm {\rm{SE}}$; g/kg 脂肪酸 fatty acid 低密度组 low density 高密度组 high density 脂肪酸 fatty acid 低密度组 low density 高密度组 high density 肉豆蔻酸 C14∶0 0.23±0.055 0.50±0.039* 芥酸 C22∶1n9 0.16±0.060 0.10±0.004 棕榈酸 C16∶0 5.25±0.173 7.75±0.357* EPA C20∶5n3 0.08±0.011 0.14±0.019 棕榈油酸 C16∶1 0.44±0.086 0.84±0.049* 二十四碳一烯酸 C24∶1 0.12±0.030 0.09±0.004 硬脂酸 C18∶0 1.67±0.129 2.03±0.061* DHA C22∶6n3 1.43±0.383 1.38±0.116 油酸 C18∶1n9c 6.18±0.848 10.43±0.461* ∑SFA 7.14±0.135 10.28±0.455* 亚油酸 C18∶2n6c 6.54±0.473 10.18±0.618* ∑MUFA 7.23±0.878 11.35±0.519* α-亚麻酸 C18∶3n3 0.36±0.050 0.65±0.056* ∑PUFA 9.07±0.114 13.11±0.808* 花生烯酸 C20∶1 0.32±0.035 0.49±0.015* ∑EPA+DHA 1.51±0.393 1.51±0.134 二十碳二烯酸 C20∶2 0.30±0.003 0.39±0.014* ∑n-3 PUFA 1.86±0.343 2.17±0.178 花生三烯酸 C20∶3n6 0.13±0.008 0.14±0.005 ∑n-6 PUFA 6.90±0.418 10.55±0.637* 花生四烯酸 C20∶4n6 0.24±0.049 0.23±0.020 n-3 PUFA/n-6 PUFA 0.27 0.21 注：SFA饱和脂肪酸；MUFA单不饱和脂肪酸；PUFA多不饱和脂肪酸；*表示组间差异显著 (P<0.05). Note: SFA means saturated fatty acid; MUFA means monounsaturated fatty acid; PUFA means polyunsaturated fatty acid. * indicates significant difference between different densities (P<0.05).

表3 　不同养殖密度下大口黑鲈肌肉脂肪酸含量及组成 Tab. 3 　Content and composition of fatty acids in muscle of Micropterus salmoides at different stocking densities n=3; $\bar x \pm {\rm{SE}}$; g/kg

图3

图3 　不同密度大口黑鲈肌肉差异代谢物a. PLS-DA得分图；b. 响应排序检验；c. 火山图；d. 代谢通路富集. Fig. 3 　Differential metabolites in the muscles of Micropterus salmoides at different densitiesa. PLS-DA score plots; b. Response ranking test; c. Volcano plot; d. Enrichment metabolic pathways.

依照HMDB分类对鉴定到的代谢物进行注释，不同养殖密度差异代谢物主要包括：脂质及类脂分子22种，核苷酸及衍生物8种，有机酸及衍生物24种及其他代谢物26种。依照Lipidmaps数据库对检测出的脂质进行注释，代谢物主要包括：19种甘油磷脂(glycerophospholipids, GP)、14种脂肪酰(fatty Acyls, FA)、3种固醇类(sterols, ST)和1种甘油酯类(glycerolipids, GL)。

KEGG分析显示14个差异代谢物显著富集于4条代谢通路，分别为不饱和脂肪酸的生物合成(biosynthesis of unsaturated fatty acids)、苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)、烟酸和烟酰胺代谢(nicotinate and nicotinamide metabolism)以及戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化(pentose and glucuronate interconversions)(图3d)。与L组相比，H组不饱和脂肪酸生物合成途径中差异代谢物除亚油酸外均上调，苯丙氨酸代谢途径中4-羟基苯甲酸、延胡索酸上调，苯丙酮酸和酪氨酸下调；另外，烟酰胺、二羟丙酮磷酸、D-5-磷酸核酮糖下调，α-酮戊二酸上调(表4)。

原始数据过滤后获得>99.3%有效数据，两组碱基质量得分Q₂₀均在97.5%以上，Q₃₀均在93.2%以上，且两组数据GC比例均在正常范围内，表明本次测序质量较高，可用于后续分析(表5)。尽管PCA结果显示，H组和L组样本并没有显著的分开，但不同密度组肌肉共有688个基因差异表达，与L组相比，H组引起508个基因表达量上调和180个基因表达量下调(图4)。

GO富集分析结果表明，差异基因在分子功能(molecular function)、细胞组分(cellular component)和生物过程(biological process)中均有分布(图5)。在生物过程中，差异基因主要富集于单有机体过程(single-organism process)、细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)以及发育过程(developmental process)，尤其富集于细胞外结构组织(extracellular structure organization)、解剖结构发育(anatomical structure development)；在分子功能中，差异基因主要富集于结合(binding)与催化活性(catalytic activity)，尤其富集于蛋白质结合(protein binding)、肽酶结合(peptidase activity)；在细胞组成中，差异基因主要富集于细胞及细胞部分(cell part)、细胞器及细胞器部分(organelle part)、膜与膜部分(membrane part)，尤其富集于胞外基质(extracellular matrix)、胞间连接(cell-cell junction)等。

表4

表4 　不同养殖密度下大口黑鲈肌肉差异代谢途径及代谢物 Tab. 4 　Differentially expressed metabolic pathways and metabolites in muscle of Micropterus salmoides at different stocking densities 代谢物metabolite HMDB分类HMDB classification 低密度组low density 高密度组high density P 组间比较intergroup comparison 代谢途径matabolic pathway 棕榈酸 palmitic acid fatty acyls 49435338.55 183849662.9 0.00219 ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成biosynthesis of unsaturated fatty acids 花生四烯酸 arachidonic acid fatty acyls 193107895.9 506430604 0.00517 ↑ 二十二碳四烯酸adrenic acid fatty acyls 1373461.945 8599354.545 0.00592 ↑ 二十碳五烯酸 EPA fatty acyls 7266361.755 26883399.75 0.00959 ↑ 二十二碳六烯酸 DHA fatty acyls 790731185.3 1789355944 0.01076 ↑ 亚油酸 linoleic acid fatty acyls 5929970.382 1989335.407 0.00880 ↓ 4-羟基苯甲酸 4-hydroxybenzoic acid benzene and substituted derivatives 2431389.061 3187719.406 0.04939 ↑ 苯丙氨酸代谢 phenylalanine metabolism 苯丙酮酸 phenylpyruvic acid benzene and substituted derivatives 2756448.411 479646.3937 0.00326 ↓ 酪氨酸 L-tyrosine carboxylic acids and derivatives 512103770.4 218065874.4 0.01496 ↓ 延胡索酸 fumaric acid carboxylic acids and derivatives 24411290.37 50954262.41 0.02285 ↑ 延胡索酸 fumaric acid carboxylic acids and derivatives 24411290.37 50954262.41 0.02285 ↑ 烟酸和烟 酰胺代谢 nicotinate and nicotinamide metabolism 烟酰胺 nicotinamide pyridines and derivatives 9832934173 6078406219 0.04981 ↓ 二羟丙酮磷酸 dihydroxyacetone phosphate organooxygen compounds 191246051.4 73398671.14 0.00033 ↓ 二羟丙酮磷酸 dihydroxyacetone phosphate organooxygen compounds 191246051.4 73398671.14 0.00033 ↓ 戊糖和葡萄糖醛酸相互转化pentose and glucuronate interconversions D-5-磷酸核酮糖 D-ribulose 5-phosphate organooxygen compounds 406712522.4 226329366.4 0.02944 ↓ α-酮戊二酸 alpha-ketoglutaric acid keto acids and derivatives 4833410.231 9651355.977 0.00818 ↑

表4 　不同养殖密度下大口黑鲈肌肉差异代谢途径及代谢物 Tab. 4 　Differentially expressed metabolic pathways and metabolites in muscle of Micropterus salmoides at different stocking densities

表5

表5 　测序数据统计 Tab. 5 　Statistics of sequencing data 样品sample 原始数据raw reads 有效数据clean reads Q20/% Q30/% GC含量/% GC content 总比对total mapped H-1 39496716 39249262 (99.37%) 97.78 93.80 50.98 37942893 (96.71%) H-2 37647548 37411344 (99.37%) 97.84 93.91 50.71 36178221 (96.75%) H-3 36717006 36484360 (99.37%) 97.87 94.00 50.77 35287027 (96.79%) L-1 36778486 36539218 (99.35%) 97.67 93.55 50.76 35268721 (96.59%) L-2 39912550 39664004 (99.38%) 97.56 93.27 50.62 38237824 (96.45%) L-3 47822302 47540264 (99.41%) 97.87 93.94 50.71 46094495 (97.00%)

表5 　测序数据统计 Tab. 5 　Statistics of sequencing data

图4

图4 　不同密度大口黑鲈肌肉差异表达基因a. 样本相关性；b. 差异表达基因数量；c. 火山图. Fig. 4 　Differently expressed genes (DEGs) in the muscles of Micropterus salmoides at different densitiesa. The correlation of samples; b. The number of differently expressed genes; c. Volcano plot.

图5

图5 　差异表达基因GO富集分析 Fig. 5 　GO enrichment analysis for DEGs

KEGG富集分析显示，差异表达基因主要富集于生物体系统(organismal systems)、新陈代谢(metabolism)、环境信息过程(environmental information processing)等5个一级分类中(图6a)。由图6b所示，差异基因主要集中于ECM-受体相互作用(ECM-receptor interaction)、黏着斑(focal adhesion)、紧密连接(tight junction)、PI3K-Akt信号通路(PI3K- Akt signaling pathway)、蛋白质消化吸收(protein digestion and absorption)等信号通路；同时高养殖密度还影响氮代谢(nitrogen metabolism)、嘧啶代谢(pyrimidine metabolism)、烟酸和烟酰胺代谢(nicotinate and nicotinamide metabolism)以及糖胺聚糖降解(glycosaminoglycan degradation)等信号通路。此外，在ECM-受体互作信号通路中，高养殖密度引起24个基因显著上调，2个基因显著下调(图6c)；在PI3K-Akt信号通路中，高养殖密度引起31个基因显著上调，7个基因显著下调(图6d)。

如图7所示，所选6个差异基因的表达与转录组测序分析结果趋势一致，进一步相关性分析表明二者具有显著相关性(r=0.863, P=0.027)，表明转录组测序分析结果可靠。

自由基是由机体产生的具有较高氧化活性的物质，参与维持机体多项生理活动，主要为活性氧自由基。拥挤胁迫下鱼体可产生过量活性氧自由基，导致抗氧化系统损伤以及氧化还原平衡破坏^[8]。一般情况下过量自由基可被抗氧化酶体系清除^[18]，当鱼类遭受严重的应激时，氧化还原平衡被打破，抗氧化酶活性下降^[19]，进而引起细胞或组织损伤。高养殖密度条件下，团头鲂(Megalobrama amblycephala)幼鱼^[20]肌肉抗氧化系统异常；红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)^[21]抗氧化能力降低且增强脂质过氧化；西伯利亚杂交鲟[Acipenser baerii (♀)×Acipenser schrenckii (♂)]^[22]抗氧化酶活性被抑制，产生氧化损伤。除养殖鱼类外，高密度胁迫也会显著影响中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)^[23]生长和抗氧化能力。本研究表明，高养殖密度引起T-AOC的显著降低，这与太湖鲂鲌[Culter alburnus (♀)×Megalobrama terminalis (♂)]^[24]、红鳍东方鲀^[21]等的结果相似。此外本研究结果还显示，在高密度中CAT活性降低，MDA含量增加，但差异不显著，表明高养殖密度引起了适度的氧化应激，其产生的影响可能在肌肉抗氧化酶系统耐受范围之内。

鱼类肌肉必需氨基酸成分相对稳定均衡，并具有鲜美的风味，易消化吸收^[25]。养殖密度是影响养殖鱼类肌肉营养成分的重要因素之一，不适宜的养殖密度会造成鱼类肌肉营养下降。已有研究表明，慢性拥挤胁迫影响肌肉蛋白质含量^[26]；高养殖密度导致团头鲂幼鱼肌肉脂肪含量及肌肉品质下降^[19]；草鱼(Ctenopharyngodon idella)^[27]在高密度养殖时，肌肉氨基酸、脂肪酸含量升高而脂质含量降低。本研究结果表明，稻田养殖大口黑鲈富含多种氨基酸，各组EAA/TAA比例均在40%~42%之间，EAA/NEAA比例均>79%，符合WHO/FAO提出的参考蛋白质模式标准(EAA/ TAA≈40%, EAA/NEAA>60%)^[4]。H组EAA/TAA低于L组，且缬氨酸含量显著降低，表明该密度下大口黑鲈肌肉氨基酸代谢受到抑制，进而影响肌肉营养价值。

脂肪酸是影响肌肉品质的种养物质，参与多种生理功能。SFA优先被氧化供能，而当机体能量需求高时，油酸可被用作备用能源物质^[28]，但过度摄入肉豆蔻酸和棕榈酸会升高胆固醇和导致高血脂^[29]。n-3 PUFA可以改善心血管健康，调节血糖血脂，促进神经系统发育^[30]; n-6 PUFA与n-3 PUFA存在代谢竞争，当n-3 PUFA摄入不足时易造成n-6 PUFA衍生物增加。本研究结果表明，稻田养殖大口黑鲈富含多不饱和脂肪酸，具有较高的营养价值；H组∑SFA、棕榈酸和油酸含量显著高于L组，可能是由于高养殖密度下，鱼类为了应对不利的胁迫而提高了脂肪的合成和存储以提供更多的能量物质。此外H组不饱和脂肪酸升高以及n-3/n-6 PUFA降低对黑鲈肌肉营养价值产生不利的影响。

图6

图6 　差异表达基因KEGG富集分析a. KEGG二级分类差异基因富集；b. KEGG前18条富集途径；c. ECM-受体互作差异基因富集；d. PI3K-Akt信号通路差异基因富集. Fig. 6 　KEGG enrichment analysis for DEGsa. DEGs enrichment in the secondary class; b. The top 18 enriched KEGG pathways; c. DEGs enriched in the ECM-receptor interaction; d. DEGs enriched in the PI3K-Akt signaling pathway.

图7

图7 　qRT-PCR与转录组测序的基因表达验证a. 差异基因表达量；b. qPCR数据与RNA-seq数据之间的相关性分析. Fig. 7 　Gene expression verification by qRT-PCR and transcriptome sequencinga. Differential gene expression; b. Correlation analysis between qPCR data and RNA-seq data.

水产品风味也是评判肌肉品质的指标之一，其非挥发性成分受呈味氨基酸、核苷酸、糖类等物质及其相互反应的多重因素影响^[27]。游离氨基酸作为肌肉风味前体物质，可以改善肌肉风味；PUFA会对于肌肉风味产生重要的影响，其氧化后会形成多种小分子挥发性化合物，既有独特的香味又能相互作用产生新的风味，肌肉中n-3 PUFA可以产生令人愉悦的风味，而n-6 PUFA则会对肌肉香气产生负面影响^[31]。本研究中，高养殖密度引起游离组氨酸含量显著下降，游离甘氨酸和鲜味氨基酸显著增加，可能由于密度胁迫增加了鱼体竞争，从而增大运动，提高鲜味氨基酸的含量^[32]。另外，高密度下PUFAs含量与n-6 PUFA含量显著增加，n-3/n-6 PUFA比例降低，表明该条件对鱼肉风味可能产生不良影响，具体作用机制有待进一步研究。

现有研究表明，高养殖密度对于鱼类脂质、蛋白质、糖类的生物合成与代谢具有负面影响^[33]，如高密度养殖大口黑鲈易发生脂质代谢紊乱现象，PPARα信号通路、脂肪细胞因子信号通路等途径下调^[17]。同时，高密度养殖引起草鱼胆固醇合成及代谢、脂肪酸代谢、脂肪消化吸收等途径异常，脂质及糖类代谢相关基因下调^[34]。对细鳞鲑(Brachymystax lenok)^[35]的代谢机制研究表明，高养殖密度会抑制脂质代谢，改变氨基酸和胆碱代谢并引起鱼体代谢异常。本研究代谢组分析显示，20种氨基酸及类似代谢物在高密度组中相对含量降低，表明高密度养殖可能会对多种蛋白质和氨基酸的代谢产生负面影响，进而影响鱼类生理活动。此外，高养殖密度引起20-羧基白三烯B4、反式油酸、棕榈酸等升高，这些脂质代谢物升高可刺激机体产生炎症反应^[36-37]。KEGG通路富集发现，高密度养殖影响营养物质的合成代谢，如促进不饱和脂肪酸生物合成、氨基酸代谢、糖类转化途径，导致代谢紊乱。高密度组二羟丙酮磷酸的下调以及α-酮戊二酸、延胡索酸的上调，表明不利环境下大口黑鲈促进TCA循环以提供更多能量。烟酰胺参与多种生理活动，可有效降低血液胆固醇、促进脂质合成、缓解氧化应激和炎症反应^[38]。高密度组烟酰胺含量下降，表明机体脂质代谢与抗氧化状态受到负面影响。

养殖密度对鱼类代谢功能的影响体现在多个基因和通路调控中。前期研究表明，过高的养殖密度会阻碍鱼类正常生长并引起肌肉应激和代谢异常，如脂质合成或分解、代谢的受阻、氧化应激等^[17]。本研究发现，高养殖密度引起的688个差异表达基因，主要与胞外结构与细胞黏附功能相关；同时，KEGG富集显示，差异基因主要集中于ECM-受体相互作用、紧密连接、PI3K-AKT信号通路以及蛋白质消化吸收途径等。PI3K-AKT信号通路为胞内信号转导途径，易被外界因素激活从而调节细胞功能，参与细胞生长代谢、增殖或抗凋亡等，同时该通路也参与脂质合成转运与代谢调控^[39]。转录组学分析显示，PI3K-AKT信号通路和ECM-受体互作通路呈上调趋势，表明细胞内外信号传导途径可能被激活，促进代谢功能以及细胞生长增殖，有益于机体适应不利的环境；此外高养殖密度引起氧化应激，激活PI3K-AKT信号通路，促进细胞的生长和存活，是一种机体应对不利环境的适应性响应机制。

本研究首次联合应用生理生化指标、代谢组学和转录组学方法研究稻-鲈共作模式下高养殖密度对大口黑鲈肌肉抗氧化状态、肌肉营养风味、代谢功能的影响。高密度养殖引起适度氧化应激，导致机体抗氧化能力降低。高密度组必需氨基酸比例、n-3/n-6 PUFA下降，饱和脂肪酸含量增加，表明该条件下鱼体肌肉营养品质和风味受影响。代谢组学与转录组学分析结果表明高养殖密度下鱼体脂质、糖类物质和蛋白质的代谢功能都受到显著影响，并可通过上调胞内及胞间的信号通路以适应不利的环境。本研究结果为稻渔综合种养系统中养殖鱼类响应环境胁迫的分子机制研究提供了新思路。