2023, Vol. 30 
2. 大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室，上海 201306
3. 国家远洋渔业工程技术研究中心，上海 201306
4. 农村农业部大洋渔业开发重点实验室，上海 201306
5. 农村农业部大洋渔业资源环境科学观测实验站，上海 201306
2. Key Laboratory of Sustainable Exploitation of Oceanic Fisheries Resources, Ministry of Education, Shanghai 201306, China
3. National Distant-water Fisheries Engineering Research Center, Shanghai 201306, China
4. Key Laboratory of Ocean Fisheries Exploitation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai 201306, China
5. Scientific Observing and Experimental Station of Oceanic Fishery Resources, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai 201306, China
灯笼鱼科(Myctophidae)鱼类包含34属225种。在世界各大洋广泛分布[1]，主要分布于大洋的中深层[2]，具有垂直迁移的生活特性[3]。白天灯笼鱼栖息于水下100~200 m处，夜晚浮出水面捕食桡足类等小型无脊椎动物[4-6]。同时，灯笼鱼也是大洋高经济价值鱼类的重要食物来源[7-8]，位于大洋食物网的中生态位，起着重要的生态作用。灯笼鱼作为传统商业捕捞中常见的兼捕种[9]，由于个体较小，经济价值较低，全球范围体系化的捕捞活动较少，商业化进展缓慢。随着高价值鱼类的过度捕捞，研究者将焦点放到以往被忽视的低价值鱼类和水生生物中，如灯笼鱼与深海头足类[2]。西北太平洋海域属于高生产力海洋系统，也是亲潮寒流与黑潮暖流交汇区域[10]，虽是多种经济鱼类的渔场，但生物多样性水平较低。灯笼鱼科鱼类作为西北太平洋海域优势种[9]，由于资源量大，蛋白质含量高，被人们逐渐重视。为了更好地实现灯笼鱼科鱼类资源的可持续利用和开发，应对灯笼鱼科鱼类进行正确的物种鉴定及更深入的系统进化研究。
传统的灯笼鱼科鱼类物种鉴定方法主要为形态学鉴定，依赖于灯笼鱼发光器的数目与排列，以及鳍条数目进行辨别[11-12]。由于灯笼鱼科鱼类种类繁多，且同属鱼类形态学相近，在捕捞过程中作为鉴定依据的发光器容易损坏与脱落，形态学鉴定易出现误差[1]。而分子生物学鉴定不依赖于样本的完整性，可通过DNA对样本进行精确鉴定[13]。DNA条形码是生物体内能够代表该物种的，标准的、具有一定变异的、易扩增的DNA片段[14]，已成功在海洋鱼类物种鉴定与系统进化分析中运用，弥补了传统形态学鉴定的不足[15-18]。Batta-Lona等[3]利用CO I基因对形态学难以准确识别的灯笼鱼稚鱼进行鉴别，结果表明形态学与分子鉴定结合所得到的鉴定结果更加精确。Lee等[1]利用16S rRNA基因对灯笼鱼进行物种鉴定，发现了韩国海域以往从未出现的喀氏眶灯鱼(Diaphus garmani)，结果表明16S rRNA基因可有效分辨灯笼鱼科鱼类隐存种。Gallet等[4]利用CO I基因对大西洋石油泄漏区的灯笼鱼遗传多样性进行研究，发现CO I基因可有效进行灯笼鱼科鱼类遗传多样性研究。可见以往使用DNA条形码对灯笼鱼进行物种鉴定主要以CO I和16S rRNA基因为主，鲜少将Cyt b和12S rRNA基因用于灯笼鱼科鱼类的物种鉴定中。
细胞色素b基因(cytochrome b, Cyt b)是线粒体基因的13个蛋白质编码基因之一，且进化速率适中，相对保守，是合适的物种鉴定标记[19-20]。杨天燕等[19]利用Cyt b基因对龙头鱼科及其近缘的灯笼鱼科等物种进行系统发育分析，结果表明灯笼鱼属(Myctophum)与底灯鱼属(Benthosema)间具有较近亲缘关系。王利华等[21]利用CO I与Cyt b基因对6种鲌属(Culter)鱼类的遗传距离与系统进化关系进行分析，探讨了这两种基因在鲌属鱼类分子鉴定中的可行性，发现Cyt b基因可以对6种鲌属鱼类进行更有效的区分。李楠等[22]利用形态学鉴定与分子进化树分析对CO I基因与Cyt b基因在中国常见河豚物种鉴定中的适用性进行研究，研究表明CO I基因与Cyt b基因均可对河豚鱼进行有效区分。12S rRNA属于不编码蛋白质，大部分变异为中性突变，进化速率较快，因此能够有效地对物种间的同源性进行比较，已被广泛应用于鱼类系统进化分析中[23-25]。张凌[26]利用12S rRNA基因构建系统进化树，研究湖鲚(Coilia macrognathos)、短颌鲚(Coilia brachygnathus)是否属于刀鲚(Coilia macrognathos)新亚种，研究表明湖鲚、短颌鲚实为刀鲚的淡水生态型种群，并非新的有效物种。於俊琦等[27]利用12S rRNA基因对浙南海域舌鳎属(Cynoglossidae)鱼类系统进化关系进行研究，结果表明，12S rRNA基因可对除长吻红舌鳎外(Cynoglossus lighti)其他舌鳎属鱼类进行有效系统进化分析。
本研究基于Cyt b基因和12S rRNA基因对西北太平洋采集的56尾灯笼鱼科鱼类进行物种鉴定以及系统发育分析，同时对这2种分子标记在灯笼鱼科鱼类物种鉴定的适用性进行探讨。
1 材料与方法 1.1 样品采集本实验灯笼鱼样本由上海海洋大学“淞航”号科考船于2022年6—7月采集于西北太平洋海域，随后立即保存于−80 ℃冰箱运回实验室。随机从5个灯笼鱼种类丰富的站点选取56尾样本，详细采样信息见表1。
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表1 本研究采样站点信息 Tab. 1 Sampling sites information in the study |
取灯笼鱼样本尾部肌肉组织20 mg，采用生工Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取样本基因组DNA。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，存储于−20 ℃冰箱备用。
选取Cyt b通用引物H14724、H15149[28]以及12S rRNA通用引物M13Li[29]扩增线粒体DNA Cyt b、12S rRNA基因，引物序列如表2。PCR总反应体系为25 μL，包括12.5 μL 2X SanTaq PCR Mix，正反向引物各1 μL, DNA模板1 μL，超纯水9.5 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 57 ℃退火45 s, 72 ℃延伸50 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，送往上海生工生物公司进行测序。
1.3 数据处理使用NCBI Blast工具对所得样本序列进行物种鉴定。由于NCBI数据库中缺乏灯笼鱼科Cyt b基因与12S rRNA序列，选择下载灯笼鱼科19属29种鱼类的线粒体全基因组序列，选取翘嘴鲌(Culter alburnus)作为外群，详见表3，并于线粒体全基因组序列截取相应的Cyt b基因与12S rRNA基因序列。使用MEGA 7.0软件进行剪切比对，统计基因序列以及相应核苷酸序列变异情况。使用K2P模型对灯笼鱼科鱼类基于Cyt b基因及12S rRNA基因的种内、种间以及属内、属间遗传距离进行计算，并使用邻接法(neighour- joining, NJ)构建分子系统进化树。
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表2 引物信息 Tab. 2 PCR primer information |
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表3 用于构建系统进化树的物种序列来源 Tab. 3 Sequences resources used in phylogenetic tree construction |
从灯笼鱼样本中提取片段完整的基因组DNA。利用Cyt b和12S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，获得特异性条带，产物电泳结果如图1所示。
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图1 灯笼鱼科鱼类Cyt b基因及12S rRNA基因PCR产物 Fig. 1 PCR profile of Cyt b and 12S rRNA genes of Myctophidae |
56尾灯笼鱼Cyt b和12S rRNA的序列比对和物种鉴定结果见表4。除T33-1、T5-1及T14-8这3尾灯笼鱼应用12S rRNA鉴定为日本背灯鱼(Notoscopelus japonicus), Cyt b鉴定为长体背灯鱼(Notoscopelus elongatus)外，其余样本两基因鉴定结果一致。此前经形态学初步分类为粗鳞灯笼鱼(Myctophum asperum)的灯笼鱼中，T33站点的在本研究中鉴定为粗鳞灯笼鱼；T14站点的在本研究中鉴定为细泰勒灯鱼(Tarletonbeania crenularis); T15站点的形态如图2a的灯笼鱼被鉴定为粗鳞灯笼鱼，形态如图2b的被鉴定为细泰勒灯鱼。经形态学鉴定初步分类为白皮灯笼鱼的灯笼鱼样本中，在T33、T15、T14 3个站点中均被鉴定为瓦氏角灯鱼(Ceratoscopelus warmingii)，而在站点T5中形态如图2c的被鉴定为瓦氏角灯鱼，形态如图2d的被鉴定为长体标灯鱼(Symbolophorus californiensis)。黑眼灯笼鱼经分子生物学鉴定为日本背灯鱼(Notoscopelus japonicus)。
2.3 灯笼鱼Cyt b和12S rRNA序列特征分析56尾灯笼鱼序列特征如表5所示。Cyt b基因中包含81个保守位点，326个变异位点，171个简约信息位点及155个单突变位点；12S rRNA基因中包含145个保守位点，629个变异位点，588个简约信息位点及40个单突变位点。Cyt b基因的颠换值为1.55, 12S rRNA基因的颠换值为1.01。
Cyt b基因的平均碱基组成为C 31.2%、T 27.2%、A 24.9%、G 16.7%, 12S rRNA基因的平均碱基组成为T 26.3%、G 26.1%、C 24.7%、A 22.9%, Cyt b基因A+T (52.1%)含量高于C+G (47.9%)含量，表现出A+T的偏倚性；12S rRNA序列A+T (49.2%)含量稍小于C+G (50.8%)含量。且Cyt b序列中第三密码子呈明显反CG偏倚，CG含量为42.5%。而12S rRNA序列中反CG偏倚则体现在第一密码子中，为47.1%。
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表4 2种鱼类DNA条形码序列在56尾灯笼鱼中的物种鉴定结果 Tab. 4 Species identification of two candidate barcode sequences in 56 fishes of Myctophidae |
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图2 灯笼鱼部分样本图片 Fig. 2 Partial sample photos of fishes in Myctophidae |
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表5 碱基平均分布频率 Tab. 5 Average nucleotide frequencies |
比较分析基于Cyt b和12S rRNA 2种基因序列的6种灯笼鱼种内种间核苷酸多态性，以100 bp核苷酸开口中点为横坐标，并分别以核苷酸多态性指数和核苷酸多态位点个数为纵坐标，绘制Cyt b基因与12S rRNA基因的核苷酸多态性指数分析图(图3)及核苷酸多态位点数图(图4)。
由图3a显示灯笼鱼科鱼类总体Cyt b基因核苷酸多态性较高，鉴定得出的6种灯笼鱼科鱼类种内核苷酸多态性均在较低水准，且高变区域多在300~400 bp处。由图3b可知5种12S rRNA基因鉴定得出的灯笼鱼高变区域为500~650 bp，尤其是日本背灯鱼的核苷酸多态性明显高于其他物种。
由图4可知12S rRNA基因相较于Cyt b基因种内突变更高，且日本背灯鱼12S rRNA基因中430~650 bp间出现两个高变区，粗鳞灯笼鱼高变区则出现在250~300 bp间。而Cyt b基因则表现出较低的种内突变，以及较高的种间突变。
2.4 灯笼鱼种内种间遗传距离和barcoding gap检验基于Cyt b与12S rRNA基因的灯笼鱼科鱼类遗传距离分析结果见表6。在12S rRNA基因中，笔者剔除了T33-1、T5-1、T14-8 3个鉴定为背灯鱼属的样本后进行遗传距离分析，得到种内遗传距离为0.003~0.012 (平均为0.006)，种间遗传距离为0.108~0.184 (平均为0.155)，种间平均遗传距离是种内遗传距离的26倍。在Cyt b基因中，种内遗传距离为0.001~0.029 (平均为0.009)，种间的平均遗传距离为0.224，是种内遗传距离的25倍。
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图3 基于Cyt b (a)和12S rRNA (b)的6种灯笼鱼种内种间核苷酸多态性比较CW：瓦氏角灯鱼；MA：粗鳞灯笼鱼；NJ：日本背灯鱼；SC：长体标灯鱼；TC：细泰勒灯鱼；NE：长体背灯鱼. Fig. 3 Comparison of intra-specific and inter-specific nucleotide polymorphism based on Cyt b (a) and 12S rRNA (b) sequences of 6 Myctophidae speciesCW: Ceratoscopelus warmingii; MA: Myctophum asperum; NJ: Notoscopelus japonicus; SC: Symbolophorus californiensis; TC: Tarletonbeania crenularis; NE: Notoscopelus elongatus. |
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图4 基于Cyt b (a)、12S rRNA (b)的6种灯笼鱼种内种间核苷酸多态位点比较CW：瓦氏角灯鱼；MA：粗鳞灯笼鱼；NJ：日本背灯鱼；SC：长体标灯鱼；TC：细泰勒灯鱼；NE：长体背灯鱼. Fig. 4 Comparison of intra-specific and inter-specific of nucleotide variable sites based on Cyt b (a) and 12S rRNA (b) sequences of 6 Myctophidae speciesCW: Ceratoscopelus warmingii; MA: Myctophum asperum; NJ: Notoscopelus japonicus; SC: Symbolophorus californiensis; TC: Tarletonbeania crenularis; NE: Notoscopelus elongatus. |
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表6 灯笼鱼科Cyt b及12S rRNA序列不同分类水平遗传距离 Tab. 6 Genetic distances according to different taxonomic levels within Myctophidae based on Cyt b and 12S rRNA sequences |
Barcoding gap是理想遗传变异条件下，种内与种间遗传距离之间明显的不重叠间隔区(图5a)[30-32]。由图5可得Cyt b基因与12S rRNA基因均存在明显的条形码间隙，不存在重叠区，以证实各物种的有效性。
2.5 灯笼鱼系统进化关系为进一步验证分子鉴定结果的准确性，采用邻接法构建基于12S rRNA (图6)和Cyt b基因(图7)序列的灯笼鱼科鱼类进化树。基于Cyt b和12S rRNA基因序列的NJ进化树自测序列结果基本一致，同种个体均先聚集成为一个单系，且具有较高的支持率。基于12S rRNA基因绘制的NJ进化树中，本研究自测序列与NCBI数据库中同种灯笼鱼序列并未聚为一支，而是分为两个大支。
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图5 不同DNA条形码候选序列遗传距离分析图条形码间隙演示图（a）, 12S rRNA（b）, Cyt b（c）序列的K2P遗传距离分布. Fig. 5 Gentic distance distribution of different DNA candidate bar codesSchematic of the barcoding gap(a), K2P genetic distance of 12S rRNA (b) and Cyt b (c) sequences. |
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图6 基于Cyt b基因的灯笼鱼科鱼类NJ进化树 Fig. 6 NJ tree based on Cyt b sequence of Myctophidae |
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图7 基于12S rRNA基因的灯笼鱼科鱼类NJ进化树 Fig. 7 NJ tree based on 12S rRNA sequence of Myctophidae |
灯笼鱼因种类繁多、仔稚鱼形态特征相近，对传统形态学分类造成巨大影响。DNA条形码可简便高效地为物种分类鉴定提供有力证据。BLAST是用于比对研究样本与数据库序列相似度以确认物种的搜索程序，置信度越高代表比对结果越可信[33]。Zhang等[34]将置信度98%作为判断所测样本与比对数据库样本是否属于同一种类的分界值。本研究中T33-1、T5-1、T14-8这3个样本BLAST比对结果分别为日本背灯鱼(Cyt b)与长体背灯鱼(12S rRNA)，但其置信度均低于98%，由于NCBI数据库中灯笼鱼属Cyt b与12S rRNA基因数据缺乏，推断这3个样本可能为背灯鱼属其他鱼类物种。整体上12S rRNA基因(92.68%~99.86%)置信度高于Cyt b基因(87.30%~ 99.76%)，就分子鉴定结果而言12S rRNA基因在灯笼鱼科鱼类物种鉴定中置信度更高。
碱基偏倚性在生物中广泛存在，不同类型不同生境的物种，其碱基使用也存在较大差异，对碱基偏倚性的分析有助于了解物种进化过程中自然选择与基因突变的过程[19]。李明辉等[35]利用DNA条形码技术对我国黄渤海虾虎鱼(Gobilidae)进行物种鉴定与系统进化研究，并分析了13种黄渤海虾虎鱼的碱基组成，发现A+T碱基含量偏高。本研究中，Cyt b基因A+T (52.1%)>C+G (47.9%)符合海水鱼类中A+T含量偏高规律，这与Ward等[30]研究的海水鱼类碱基偏倚结果一致。而12S rRNA基因中A+T (49.2%)<C+G (50.8%), C+G含量较高，呈现不明显的CG偏倚。通常DNA序列在进化过程中基因转换的频率会高于基因颠换的频率，因此转换/颠换的比值R可用于评估DNA进化速率[35]。武宝生等[36]研究认为，当R值小于2时，基因突变达到饱和状态，并且受到进化噪声影响的可能性较大。本研究中灯笼鱼Cyt b基因颠换值R为1.55, 12S rRNA基因颠换值为1.01，均小于2，说明这两个基因突变已达饱和状态，并且在进化过程中都受到了进化噪声影响[37-38]，且12S rRNA进化速率更快。
核苷酸多样性与种内种间平均遗传距离是衡量线粒体DNA遗传变异的重要依据[38]。且核苷酸多样性指数可以兼顾不同的线粒体DNA单倍型在群体中所占的比例，因此相较于单纯的平均遗传距离，两者相结合可以更好地反映线粒体DNA多态性[39]。蒋芝华等[40]认为，高的种内与种间核苷酸多态性在鉴别近缘物种时结果更加精确。本研究中12S rRNA基因种间核苷酸多态性低于Cyt b基因，且12S rRNA基因灯笼鱼科种间的核苷酸多态性指数最低值(0.041)小于日本背灯鱼种内核苷酸多态性最高值(0.045), Cyt b基因种间核苷酸多态性指数最低值(0.115)远高于种内核苷酸多态性指数(0.018), Cyt b基因相较于12S rRNA基因具有更明显的种内与种间核苷酸多态性差距，且Cyt b种内核苷酸多态位点数也处于低水平状态，说明灯笼鱼科鱼类Cyt b序列中种内突变更少，而种间突变更为明显，因此Cyt b基因更适用于区分灯笼鱼科鱼类近缘物种。
在分子生物学鉴定中，物种种内与种间遗传距离是物种界定的标准[41]。本研究中灯笼鱼科鱼类12S rRNA基因种间遗传距离是种内遗传距离的26倍，而Cyt b基因的种间遗传距离是种内遗传距离的25倍，此外Hebert等[42]还指出，物种的种内遗传距离应小于DNA条形码规定的最大种内遗传距离0.020；在种内遗传距离中，两种基因所有物种最大种内遗传距离均小于0.020，因此均符合DNA条形码鉴定标准及“10×法则”[30,42]，可对灯笼鱼科鱼类进行准确鉴定。DNA条形码种间变异与种内变异间通常不存在重叠区，并应有明显间隔，即DNA条形码间隙(DNA barcoding gap)[43]。本研究Cyt b与12S rRNA基因均存在条形码间隙，且Cyt b基因的条形码间隙明显大于12S rRNA基因。
线粒体DNA可以精确构建系统进化关系[21]。本研究利用获得的Cyt b和12S rRNA基因进行灯笼鱼科鱼类系统进化分析，发现12S rRNA构建的NJ进化树3尾背灯鱼属鱼类与其他日本背灯鱼聚在一起形成一个复合支，亲缘关系较近，其余样本各聚为一支。基于12S rRNA基因构建的NJ进化树，自测序列与数据库序列无法形成有效聚类，分为两大支，说明12S rRNA基因适合于灯笼鱼科鱼类物种鉴定，但在较高级分类阶元中不能有效地体现灯笼鱼科鱼类进化关系。Cyt b基因构建的NJ进化树中，本研究自测序列可与数据库序列形成有效聚类，并清晰展现出系统进化关系，更适用于灯笼鱼系统进化分析。
综上所述，12S rRNA基因与Cyt b基因均能有效的对灯笼鱼科鱼类进行物种鉴定。且Cyt b基因能更好与数据库中序列进行聚类，更适用于研究灯笼鱼科鱼类系统进化关系。由于数据库中灯笼鱼科鱼类Cyt b和12S rRNA基因序列条形码信息缺乏，所以在本实验中仍有部分灯笼鱼科鱼类无法精确鉴定。因此在未来的研究中应不断完善灯笼鱼科鱼类DNA条形码数据库，并结合多基因进行比对，从而获得更准确的鉴定结果。
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