2024, Vol. 31 
2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所，海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室，山东 青岛 266071
3. 青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266237
2. State Key Laboratory of Mariculture Biobreeding and Sustainable Goods, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China
3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾，原产地在太平洋西岸水域秘鲁北部至墨西哥桑诺拉。1988年凡纳滨对虾引入中国，随后其人工繁育技术获得突破，随着国内优质新品种选育成功和基于无特定病原(specific pathogen free, SPF)虾苗养殖模式的建立，对虾养殖规模逐年扩大。在20世纪90年代，由于白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的迅速传播，对虾产业受到严重威胁，斑节对虾(Penaeus monodon)、中国对虾(Penaeus chinensis)等养殖品种大面积减产。而相对于其他对虾品种，凡纳滨对虾具有较强的抗病能力，养殖周期短，适应范围广，淡水海水均可养殖等优点，逐渐成为了我国重要的对虾养殖品种[1]。但是WSSV依然是凡纳滨对虾养殖业最主要的病原之一，具有很高的致死率[2]。因此开展凡纳滨对虾抗WSSV研究对我国对虾养殖业发展具有重要意义。
易位子相关蛋白(translocon-associated protein, TRAP)属于内质网膜蛋白，由4个蛋白质亚基组成，分别是TRAPα、TRAPβ、TRAPγ、TRAPδ[3]。其中TRAPα、TRAPβ为糖基化蛋白，TRAPγ、TRAPδ为非糖基化蛋白。TRAPα分布在内质网和核膜上，可以结合钙离子，在人类骨髓细胞中，会受到巨噬性粒细胞集落刺激因子正调控[4]。Mangos等[5]首次通过酵母双杂交的方法发现，TRAPβ在斑马鱼(Danio rerio)胚胎发育期呈现组成型表达。TRAPγ在1993年被发现，Li等[6]研究非洲爪蟾(Xenopus Laevis)时得到结论：TRAPγ的敲除能够导致非洲爪蟾近球小管的缩短和前肾小管末梢的缺失，并在前肾组织特异性基因产物转运时发挥作用。王家庆等[7]采用同源克隆的方法，通过RT-PCR结合RACE成功地从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)中分离了TRAPδ基因，且克隆了虹鳟TRAPδ的cDNA全长序列。TRAP在乙型肝炎病毒感染时，HBe前体(p25)定位到内质网进行加工的过程中发挥重要作用[8]。TRAP主要位于内质网的转位通道附近，在机体进行蛋白质生物合成过程时，蛋白质的前体新生多肽在翻译后经常会被针对性地转运至内质网，进行下一步的折叠和修饰，这个复杂的过程需要TRAP的亚基通过相互作用形成复合物共同参与相关过程[9]。TRAP复合物参与未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)，以维持细胞稳态。当细胞遇到不利条件，例如病毒感染、氧化应激和葡萄糖剥夺时，TRAP将被激活[10]。但是截止到目前，关于水产动物TRAPα基因抗病毒方面的研究较少，因此探究TRAPα基因参与凡纳滨对虾抗WSSV的研究具有重要意义。
基于课题组前期对感染WSSV的凡纳滨对虾、健康凡纳滨对虾肝胰腺转录组和基因组DNA甲基化测序数据，筛选到mRNA表达量与DNA甲基化水平均存在显著差异的TRAPα基因。为深入解析TRAPα基因在凡纳滨对虾抗WSSV过程的功能特征，本研究在转录、甲基化、SNP等水平进一步验证TRAPα基因与抗WSSV的相关性，为揭示凡纳滨对虾抗WSSV分子机制提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验用虾来自于潍坊邦普种业科技有限公司，平均体重为(2.06±0.90) g，体长为(5.73±2.30) cm。在消毒后盐度为29的SPF (无特定病原体，specific pathogen free)级海水中暂养3 d，养殖温度为25 ℃，每天喂食3次，换水量30%~40%。随机选取6尾健康凡纳滨对虾作为对照组，分别采集肝胰腺、鳃、肌肉、眼柄，迅速置于液氮中速冻后，存放于−80 ℃冰箱中保存，用于基因表达水平分析。
随机挑选90尾健康凡纳滨对虾进行WSSV感染实验，参考孟宪红等[11]WSSV毒饵制备及单尾定量口饲感染方法投喂毒饵。参考Durand等[12]的TaqMan real-time PCR技术检测肌肉组织中的WSSV含量。所用引物和探针(WSSV forward primer、WSSV reverse primer、WSSV probe)序列见表1。所用WSSV毒饵病毒载量为1×106 copies/mg，每尾虾进食WSSV含量为1×107 copies。进食毒饵的对虾转移到SPF级海水中继续饲养管理。感染WSSV后48、72、144、192 h时间点分别取6尾凡纳滨对虾，采集肝胰腺、鳃、肌肉、眼柄液氮速冻后，存放于−80 ℃冰箱中保存，用于基因表达水平分析。
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表1 引物和探针信息 Tab. 1 Primers and probes information |
感染WSSV后96 h取60尾凡纳滨对虾的肌肉组织，液氮速冻后，存放于−80 ℃冰箱中保存，用于基因表达水平与WSSV复制水平的相关分析。
从本课题组构建的32个凡纳滨对虾家系中随机挑选50尾凡纳滨对虾用于SNP位点筛选。
1.2 DNA、RNA的提取与cDNA的合成取凡纳滨对虾的肝胰腺和肌肉组织进行研磨，使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取DNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用NanoPhotometer N50 Touch分光光度计仪器测定提取的总DNA的浓度和含量。
取凡纳滨对虾的肝胰腺、鳃、肌肉、眼柄组织进行研磨，使用RNA-easy isolation reagent (南京诺唯赞生物科技股份有限公司)提取RNA，用NanoPhotometer N50 Touch分光光度计仪器测定提取的总RNA的浓度和含量，再使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。
按照HiScript®III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)试剂盒的操作说明对总RNA进行反转录，合成第一链cDNA。将反转完成的cDNA置于−80 ℃冰箱保存备用。
1.3 cDNA的PCR扩增和Sanger测序根据凡纳滨对虾TRAPα基因序列(NCBI: XM_027352485.1)，利用Primer 5.0软件设计PCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物(Lv-trapα forward primer、Lv-trapα reverse primer)序列见表1。利用PCR和Sanger测序技术获得凡纳滨对虾TRAPα的cDNA序列，并命名该基因为Lv-trapα。使用Quick taqTM HS DyeMix酶(TOYOBO)进行PCR扩增。PCR体系总体积25 μL: Quick taqTM HS DyeMix酶(TOYOBO) 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL, DNA模板1 μL, ddH2O 10.5 μL。反应程序：94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃ 30 s, 68 ℃ 1 min，共35个循环；68 ℃ 5 min。Sanger测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.4 基因序列生物信息学分析获得开放阅读框(ORF)完整编码序列后，使用在线软件ExPASy (http://web.expasy.org/)将ORF序列翻译成氨基酸序列，并预测相对分子质量和等电点、不稳定系数等。使用TMHMM (https:// services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)软件分析蛋白质的跨膜区。使用SignalP 4.1 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)软件进行信号肽预测。使用NetNGlyc 1.0 Server (https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/)软件进行糖基化位点分析。使用NetPhos 3.1 Server (https://services.healthtech.dtu.dk/services/ NetPhos-3.1/)软件进行磷酸化位点分析。运用SMART (https://smart.embl.de/)在线工具进行蛋白质功能结构域预测分析。使用SOPMA (https:// npsa-prabi.ibcp.fr/)软件进行二级结构预测。使用DNAMAN 6.0软件进行同源多序列比对分析。使用MEGA 7.0软件通过邻接法(neighbour-joining method, NJ)进行系统进化树的构建。
1.5 基因表达水平的检测 1.5.1 基因时空表达分析使用real-time PCR技术检测健康凡纳滨对虾和感染WSSV后48、72、144、192 h凡纳滨对虾肝胰腺、鳃、肌肉、眼柄4种组织的Lv-trapα表达水平。反应体系和反应条件按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO)试剂盒说明进行操作。反应体系共20 μL: SYBR Green Realtime PCR Master Mix为10 μL，上下游引物分别0.8 μL, RNase-free ddH2O为6.4 μL, cDNA模板为2 μL。反应条件：95 ℃ 1 min; 60 ℃ 15 s, 95 ℃ 15 s, 72 ℃ 45 s，共40个循环，熔解曲线反应条件为：95 ℃ 15 s; 60 ℃ 1 min; 95 ℃ 1 min。18S rRNA作为内参基因，利用2−ΔΔCt方法计算Lv-trapα基因的相对表达量[13]。real-time PCR技术所用引物(qLv-trapα forward primer、qLv-trapα reverse primer; 18S rRNA forward primer、18S rRNA reverse primer)见表1，每个样品设置3次平行实验。使用SPSS 25.0软件对数据进行独立样本t检验分析，当P<0.05时认为差异显著。
1.5.2 基因表达水平与WSSV复制水平的相关分析为探索Lv-trapα基因的表达水平是否与凡纳滨对虾体内WSSV的复制水平相关，用TaqMan real-time PCR技术(方法同
将平均病毒含量为3.13×10–1±7.6×10–2的6尾对虾和平均病毒含量为1.93×10−3±3.93×10−4的6尾对虾分别作为高病毒含量(high pathogen content, HPC)组和低病毒含量(low pathogen content, LPC)组，并取健康凡纳滨对虾作为对照组，利用real-time PCR技术检测Lv-trapα基因在对照组、HPC组和LPC组的肝胰腺、鳃、肌肉、眼柄4种组织中的表达水平。使用SPSS 25.0软件对数据进行独立样本t检验分析。
1.6 重亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing PCR, BSP)法验证Lv-trapα基因甲基化水平根据课题组前期DNA甲基化测序数据，筛选出Lv-trapα基因上游存在一段甲基化水平与该基因表达水平显著负相关的区域(NCBI数据库NW_020872863.1第360201~360600 nt)。为进一步验证该区域甲基化水平是否与抗WSSV相关，开展以下实验：从HPC组、LPC组和对照组各取3尾凡纳滨对虾的肝胰腺提取DNA (方法同
从32个凡纳滨对虾家系中随机取50尾对虾，提取肌肉组织DNA (方法同
根据SNP分型结果，计算各基因型和基因频率，用PLINK1.9软件计算期望杂合度(He)、观测杂合度(Ho)、最小等位基因频率(MAF)、哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)等参数。依据Botstein等[14]给出的计算公式编写R代码计算多态信息含量(PIC)。
2 结果与分析 2.1 Lv-trapα基因及编码氨基酸序列分析本研究中，通过PCR和Sanger测序技术所得Lv-trapα基因编码序列和NCBI数据库(XM_ 027352485.1)一致。ORF全长为873 bp，编码290个氨基酸(图1)。预测相对分子质量为32466.4，理论等电点为4.45。带负电残基的数量为53，带正电残基的数量为28。不稳定系数(II)为41.62，表明该蛋白不稳定。脂溶性指数83.31。亲水性总平均值−0.286。利用NetPhos3.1 Server预测Lv-trapα蛋白的磷酸化位点有：11个丝氨酸磷酸化位点、10个苏氨酸磷酸化位点、3个酪氨酸磷酸化位点。使用NetNGlyc 1.0 Server预测在140位点、195位点有NFTA、NQTV基序的N-糖基化位点。
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图1 Lv-trapα基因cDNA序列及预测的氨基酸序列[ ]内为信号肽区域；糖基化位点用加粗和下划线标出；起始密码子和终止密码子用方框标出；磷酸化位点用绿色字体表示；标黄背景为外显子SNP位点. Fig. 1 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Lv-trapα gene[ ] is the signal peptide region, glycosylation sites are marked with bold and underlined, the start and end codons are boxed, phosphorylation sites are indicated in green font, the exon SNP site is shown in yellow background. |
预测Lv-TRAPα蛋白有跨膜区，说明该蛋白是跨膜蛋白。预测Lv-trapα蛋白有信号肽结构，剪切位点位于21~22号氨基酸之间。预测去掉信号肽的Lv-trapα蛋白的二级结构中，α螺旋占23.05% (62个氨基酸)，延伸链占22.68% (61个氨基酸), β转角占7.43% (20个氨基酸)，无规则卷曲结构占46.84% (126个氨基酸) (图2)。
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图2 Lv-TRAPα的二级结构预测c：无规则卷曲，e：延伸链，h: α-螺旋，t: β-转角. Fig. 2 Prediction of secondary structure of Lv-TRAPαc: random coil, e: extended strand, h: α-helix, t: β-turn. |
对TRAPα的氨基酸序列进行多序列比对(图3)和系统进化树分析(图4)，发现凡纳滨对虾TRAPα氨基酸序列与中国对虾TRAPα氨基酸序列同源性最高，为99.31%。与其他物种同源性为：克氏原螯虾，79.38%；三疣梭子蟹(Procambarus trituberculatus), 77.05%；红螯螯虾(Cherax quadricarinatus), 79.73%；美洲龙虾(Homarus americanus), 79.04%；中华绒螯蟹，78.26%；堆砂白蚁(Cryptotermes secundus), 55.78%；南美飞蝗(Schistocerca cancellata), 54.55%；松叶蜂(Neodiprion pinetum), 52.2%；甜瓜(Cucumis melo), 28.57%；蜗牛(Biomphalaria glabrata), 50.34%；蓝星睡莲(Nymphaea colorata), 26.67%；人(Homo sapiens), 50.67%；小鼠(Mus musculus), 47.06%；黄牛(Bos taurus), 46.95%；狗(Canis lupus familiaris), 51.11%。
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图3 TRAPα的多重氨基酸序列比对TRAPα序列GenBank登录号：中国对虾(XP_047492382.1)，克氏原螯虾(XP_045583197.1)，三疣梭子蟹(XP_045113123.1)，红螯螯虾(XP_053627371.1)，美洲龙虾(XP_042227466.1)，中华绒螯蟹(XP_050722110.1)，堆砂白蚁(XP_023726309.1)，南美飞蝗(XP_049779984.1)，松叶蜂(XP_046472440.1)，甜瓜(XP_008447984.1)，蜗牛(XP_013076474.1)，蓝星睡莲(XP_031494816.1)，人(NP_003135.2)，小鼠(NP_001347771.1)，黄牛(NP_001095592.1)，狗(NP_001003270.1). Fig. 3 Multiple comparison of amino acid sequences for TRAPαThe GenBank accession numbers of TRAPα amino acid sequences are as follows: Penaeus chinensis (XP_047492382.1), Procambarus clarkii (XP_045583197.1), Portunus trituberculatus (XP_045113123.1), Cherax quadricarinatus (XP_053627371.1), Homarus americanus (XP_042227466.1), Eriocheir sinensis (XP_050722110.1), Cryptotermes secundus (XP_023726309.1), Schistocerca cancellata (XP_049779984.1), Neodiprion pinetum (XP_046472440.1), Cucumis melo (XP_008447984.1), Biomphalaria glabrata (XP_013076474.1), Nymphaea colorata (XP_031494816.1), Homo sapiens (NP_003135.2), Mus musculus (NP_001347771.1), Bos taurus (NP_001095592.1), Canis lupus familiaris (NP_001003270.1). |
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图4 基于TRAPα氨基酸序列构建的邻接系统进化树 Fig. 4 The neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree based on TRAPα amino acid sequences |
利用real-time PCR的方法检测了Lv-trapα在健康凡纳滨对虾和感染WSSV不同时间点的凡纳滨对虾肝胰腺、鳃、肌肉、眼柄4种组织中的表达情况。结果如图5所示，Lv-trapα基因在健康对虾4种组织中均有表达，基因表达水平无显著差异。
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图5 Lv-trapα基因在健康凡纳滨对虾各组织中的表达情况 Fig. 5 Expression of Lv-trapα gene in various tissues of healthy Litopenaeus vannamei |
如图6a所示，感染WSSV后48、72、144、192 h，凡纳滨对虾肝胰腺中的Lv-trapα表达水平分别是对照组的(1.03±0.16)、(2.06±0.45)(P<0.05)、(1.75±0.57)(P<0.05)、(0.84±0.44)倍。如图6b所示，感染WSSV后48、72、144和192 h，鳃中的Lv-trapα表达水平分别是对照组的(2.32±1.21)、(3.66±1.10)(P<0.05)、(6.22±0.79)(P<0.01)、(7.20± 4.35)(P<0.05)倍。如图6c所示，感染WSSV后48、72、144和192 h，肌肉中的Lv-trapα表达水平分别是对照组的(1.51±0.68)、(1.86±0.85)、(4.50±1.56) (P<0.01)、(2.67±0.63)(P<0.01)倍。如图6d所示，感染WSSV后48、72、144和192 h，眼柄中的Lv-trapα表达水平分别是对照组的(6.32±2.12)(P< 0.01)、(10.01±2.32)(P<0.01)、(9.08±2.76)(P<0.01)、(14.81±3.17)(P<0.01)倍。
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图6 感染WSSV后不同时间Lv-trapα基因在凡纳滨对虾各组织中的表达情况a. 肝胰腺组织；b. 鳃组织；c. 肌肉组织；d. 眼柄组织. HPC：高病毒含量(平均病毒含量为3.13×10−1±7.60×10−2); LPC：低病毒含量(平均病毒含量为1.93×10−3±3.93×10−4). **表示差异极显著(P<0.01), *表示差异显著(P<0.05). Fig. 6 Expression of Lv-trapα gene in tissues of Litopenaeus vannamei at different times post WSSV infectiona. Hepatopancreatic tissue; b. Gill tissue; c. Muscle tissue; d. Eye stalk tissue. HPC: high pathogen content (the mean pathogen content is 3.13×10−1±7.60×10−2); LPC: low pathogen content (the mean pathogen content is 1.93×10−3±3.93×10−4). ** indicates extremely significant difference (P<0.01), * indicates significant difference (P<0.05). |
如图7所示，HPC组和LPC组肝胰腺中Lv-trapα表达水平分别是对照组的(2.12±0.58) (P<0.05)、(1.09±0.46)倍，HPC组和LPC组之间差异显著(P<0.05)。HPC组和LPC组鳃中的Lv-trapα表达水平分别是对照组的(11.26±3.77)(P<0.01)、(8.17±5.23)(P<0.05)倍。HPC组和LPC组肌肉中的Lv-trapα表达水平分别是对照组的(11.30±5.76) (P<0.05)、(15.45±4.03)(P<0.01)倍。HPC组和LPC组眼柄中的Lv-trapα表达水平分别是对照组的(6.22±1.83)(P<0.01)、(3.97±3.89)倍。
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图7 高病毒含量组(HPC)、低病毒含量组(LPC)和对照组中Lv-trapα基因表达情况不同字母表示有显著性差异(P<0.05). HPC：平均病毒含量为3.13×10−1±7.60×10−2; LPC：平均病毒含量为1.93×10−3±3.93×10−4. Fig. 7 Expression profile of Lv-trapα in the high pathogen content (HPC), low pathogen content (LPC) and control groupDifferent letters indicate significant difference (P<0.05). HPC: the mean pathogen content is 3.13×10−1±7.60×10−2; LPC: the mean pathogen content is 1.93×10−3±3.93×10−4. |
QUMA分析结果显示Lv-trapα基因上游区域(NCBI数据库NW_020872863.1第360201~360600 nt)存在6个CpG位点。该区域在对照组肝胰腺中甲基化率为97.91%；在HPC组肝胰腺中甲基化率为91.66%；在LPC组肝胰腺中甲基化率为95.83%。其中NCBI数据库NW_020872863.1第360336-360337 nt位置的CpG位点在对照组肝胰腺甲基化率为100%，在HPC组的肝胰腺中甲基化率为50%，在LPC组的肝胰腺中甲基化率为75% (图8)。卡方检验结果显示该CpG位点甲基化水平在HPC组中显著低于对照组(P=0.021)。
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图8 凡纳滨对虾Lv-trapα基因上游区域6个CpG位点的甲基化率a. 对照组，b. 高病毒含量组(平均病毒含量为3.13×10−1±7.60×10−2); c. 低病毒含量组(平均病毒含量为1.93×10−3±3.93×10−4). 每个圆圈代表一个CG位点；实心圆代表发生甲基化的位点；空心圆代表未发生甲基化的位点. Fig. 8 Methylation rate of six CpG sites in the upstream region of Lv-trapα in Litopenaeus vannameia. Control group; b. High pathogen content group (the mean pathogen content is 3.13×10−1±7.60×10−2); c. Low pathogen content group (the mean pathogen content is 1.93×10−3±3.93×10−4). Each circle represents a CG site, solid circles represent CG sites where methylation occurs, hollow circles represent CG sites that have not undergone methylation. |
根据测序峰图(图9)及序列比对结果共筛选到8个SNP位点，分布位置见图10。SNP位点突变类型及多态性分析结果见表2。7个SNP处于内含子区域。1个SNP处于外显子区域，属于错义突变，密码子编码氨基酸由Glu (谷氨酸)突变为Lys (赖氨酸)。多态性分析结果如表2所示。HWE检验结果表明，8个位点均符合HWE。
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表2 SNP位点突变类型及多态性分析 Tab. 2 Analysis of SNP mutation types and polymorphism |
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图9 Sanger测序结果(部分)红色箭头所指为SNP-CT基因型. Fig. 9 Sanger sequencing results (partial)The red arrow points to SNP-CT genotype. |
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图10 SNP位点在DNA序列中位置灰色部分为CDS区；加粗和下划线为SNP位点. Fig. 10 The position of the SNP locus in the DNA sequenceThe gray part is the CDS area, and the SNPs are shown in bold and underlined. |
预测去掉信号肽的突变型Lv-trapα的二级结构中，α螺旋占23.42% (63个氨基酸)，延伸链占23.42% (63个氨基酸), β转角占6.69% (18个氨基酸)，无规则卷曲结构占46.4% (125个氨基酸)(图11)。
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图11 突变型Lv-TRAPα的二级结构预测c：无规则卷曲，e：延伸链，h: α-螺旋，t: β-转角. 加粗和下划线表示突变氨基酸. Fig. 11 Secondary structure prediction of mutant Lv-TRAPαc: random coil, e: extended strand, h: α-helix, t: β-turn. Bold and underline indicate the mutant amino acids. |
TRAP在生物体合成蛋白过程中发挥重要功能，蛋白的前体新生多肽在转运至内质网的过程中需要TRAP的参与[9,15]。TRAP除了参与蛋白合成过程，也对异常蛋白降解具有重要作用。TRAP在内质网相关蛋白降解(ER-associated protein degradation, ERAD)过程中，会介导错误折叠的蛋白从内质网进入胞质中[16]。通过本研究发现，Lv-trapα蛋白存在信号肽，推测合成过程可能需要跨膜运输。本研究中也预测到Lv-TRAPα蛋白的跨膜区，这与内质网膜蛋白的功能定位一致。凡纳滨对虾TRAPα氨基酸序列与中国对虾相似性最高，而与人、小鼠等哺乳动物的相似性较低。上述结果提示随着生物界的进化，TRAPα氨基酸序列发生了较大改变。预测Lv-TRAPα蛋白存在磷酸化、糖基化位点，提示Lv-TRAPα功能可能受糖基化和磷酸化作用调控。
3.2 SNP位点多样性分析Lv-trapα基因中存在一个错义突变SNP，该突变造成密码子编码氨基酸Glu (谷氨酸)突变为Lys (赖氨酸)。谷氨酸属于酸性氨基酸，赖氨酸属于碱性氨基酸。谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位。人类的β-珠蛋白基因26位密码子GAG突变为AAG导致谷氨酸变成赖氨酸，进而导致珠蛋白肽链合成减少或缺失，临床表现为不同程度的进行性溶血性贫血[17]。该SNP突变对Lv-trapα蛋白二级结构造成一定程度的改变，是否会对蛋白功能造成影响值得进一步研究。
3.3 WSSV感染对Lv-trapα基因表达水平的影响TRAP参与生物体应对外源胁迫和病毒感染过程。根腐线虫(Pratylenchus goodeyi)在受到龙葵(Solanum nigrum)提取物胁迫时，TRAP表达水平升高[18]。HBe前体(p25)是乙型肝炎病毒合成HBe抗原的先驱蛋白，TRAP在HBe前体(p25)定位到内质网进行加工的过程中发挥重要作用。本研究中，Lv-trapα在WSSV感染的凡纳滨对虾4种组织中均显著上调表达。感染WSSV后，眼柄中Lv-trapα基因表达水平上调程度最高。在患铁虾综合征的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)眼柄转录组研究中，发现较多免疫相关的差异基因，提示眼柄在甲壳类动物先天免疫中发挥重要作用[19]。鳃是WSSV侵染的重要靶器官，Lv-trapα在感染WSSV的凡纳滨对虾鳃中随着WSSV感染时间的增加表达水平呈现明显上调的趋势。不同的是Lv-trapα在肝胰腺和肌肉中表达水平呈现先上升后下降的趋势。这提示不同组织应答WSSV侵染的机制不同。尤其在具有重要免疫功能的肝胰腺中，HPC组Lv-trapα基因的表达水平显著高于LPC组。上述结果提示Lv-trapα表达水平与凡纳滨对虾体内WSSV含量呈现正相关。在凡纳滨对虾和WSSV互作过程中，Lv-trapα可能在宿主或病毒蛋白合成过程中发挥重要调控作用，具体功能值得深入研究。
3.4 甲基化水平与基因表达水平、WSSV病毒含量的相关分析已有研究表明，DNA甲基化水平与宿主抗病基因表达与宿主抗性都存在相关性。程鸿星等[20]发现，副猪嗜血杆菌感染的猪脑组织中FRMD1和GBP1基因表达水平与DNA甲基化水平呈正相关关系，STXBP2基因表达水平与DNA甲基化水平呈负相关关系。本研究发现Lv-trapα基因上游一个CpG位点(NCBI数据库NW_020872863.1第360336~360337 nt)甲基化水平与Lv-trapα表达水平呈现负相关，同时该位点甲基化水平与凡纳滨对虾体内WSSV含量呈现负相关性。提示该甲基化位点能够影响Lv-trapα表达水平和凡纳滨对虾体内WSSV复制水平。
综上所述，凡纳滨对虾Lv-trapα在受到WSSV感染后显著上调表达，且表达水平与凡纳滨对虾体内WSSV含量呈现正相关性。Lv-trapα基因上游存在与基因表达和WSSV复制水平均呈现负相关性的甲基化位点，结果提示Lv-trapα可能在凡纳滨对虾抗WSSV中发挥重要调控作用，具体功能值得深入研究。
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