2024, Vol. 31 
2. 大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 116023
3. 上海海洋大学食品学院，上海 201306
4. 三亚热带水产研究院，海南省深远海渔业资源高效利用与加工重点实验室，海南 三亚 572018
2. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China
3. College of Food Science & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
4. Key Laboratory of Efficient Utilization and Processing of Marine Fishery Resources of Hainan Province; Sanya Tropical Fisheries Research Institute, Sanya 572018, China
珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂)是暖水性大中型海洋高档名贵鱼类，具有生长快速和抵抗力强的杂交优势，因其肉质鲜美、优质蛋白质含量高、脂肪酸中不饱和脂肪酸占比高的特点而受广大消费者青睐[1-3]。2022年我国海水养殖总产量2275.70万t，其中海水鱼类中石斑鱼产量为20.58万，同比增加0.83%[4]。活鱼营养价值远高于冻藏鱼，市场调查显示，活鱼价格是冷冻冷藏鱼的2~5倍[5]。珍珠龙胆石斑鱼多以鲜销为主，但因产销地域跨度大，其鱼鳍常因运输中多种应激影响而损伤，甚至导致死亡[6]。因此，珍珠龙胆石斑鱼在保活运输中关键技术的优化对于提高其商品价值具有重要意义。鱼类活运中合适的水温和盐度可以延长存活时间和提高运输效率[7-8], Tan等[9]在大黄鱼的保活运输中发现，低温结合二氧化碳麻醉条件下大黄鱼的运输存活率高且对鱼肉品质影响较小。袁仲瑾等[3]在珍珠龙胆石斑鱼低温暂养研究中发现，16 ℃下其非特异性免疫和抗氧化系统调控能力较强，肝脏的氧化应激损伤减小，存活时间延长。水体盐度对鱼体渗透压调节、耗氧率、能量收支平衡、饲料消化利用、生长性能、氨氮排泄和存活等多方面产生影响，过高盐度对体内免疫调节、生长行为等有消极作用。此外，冷驯是活鱼运输中必不可少的步骤，作为暂养的关键步骤之一，降温速率将直接影响鱼体健康，王彩霞等[10]在加州鲈无水保活研究中发现，适宜的降温速率对鱼肝脏和肾脏影响最小，能保证鱼的肌肉品质发生较小的变化。本研究通过探究不同模拟运输条件下珍珠龙胆石斑鱼的存活时长、血清生化指标、肝脏抗氧化指标和肝脏结构组织以及水质的变化，以期获得适合珍珠龙胆石斑鱼的低温保活运输工艺，为建立珍珠龙胆石斑鱼的保活流通规范提供数据支持。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂实验鱼珍珠龙胆石斑鱼在2021年9—12月采购于广州融渔科技有限公司，从每批购买的实验原料中，挑选活力良好的石斑鱼进行实验，实验共使用247尾鱼，体重(550±43) g，体长(21±6) cm，鱼体表完整，无体表伤，鳞片完整。适应期间鱼水重量比为1∶20，水温23~24 ℃，盐度25‰~26‰，暂养期间使用水循环系统循环过滤海水，空气泵持续供氧，水体溶解氧含量>7 mg/L。
试剂：海水晶(江西盐通科技有限公司)；冰乙酸(广州化学试剂厂)；无水乙醇、二甲苯、中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)；皮质醇测定试剂盒(上海酶联生物科技有限公司); Bradford蛋白浓度、超氧化物歧化酶活性测定试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；丙二醛检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司); HE染液套装(武汉塞维尔生物科技有限公司)
1.2 仪器与设备Multi3630 IDS便携式多参数水质分析仪(德国WTW公司); KD-2AS风冷式冷水机(广州市澳鑫设备科技有限公司); HD-A521模拟汽车运输振动试验台(东莞市海达仪器有限公司); BS-800M全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司); UV2550紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；全自动酶标仪(美国BioTek公司); 3K30高速台式冷冻离心机(德国Sigma公司); SPX智能生化培养箱(宁波江南仪器厂); T50均质机(德国IKA公司); HWS-24电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司); JB-P5包埋机(武汉俊杰电子有限公司); JB-L5冻台(武汉俊杰电子有限公司); RM2016病理切片机(上海徕卡仪器有限公司); Donatello脱水机(意大利DIAPATH公司); KD-P组织摊片机(金华市科迪仪器有限公司); Giotto染色机(意大利DIAPATH公司); Eclipse Ci-L正置光学显微镜(日本Nikon公司)。
1.3 实验方法 1.3.1 单因素实验降温速率：利用实验室自制梯度降温及暂养装置(图1)，冷水机分别以0.5 ℃/h、1 ℃/h、2 ℃/h和3 ℃/h匀速降温至16 ℃及直接降温(30 min内降至16 ℃)，鱼水重量比1∶5，盐度25‰；温度实验：冷水机以1 ℃/h降温至15 ℃、16 ℃、18 ℃、20 ℃、24 ℃，其余条件同上；盐度实验：盐度分别设为10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰，其余条件同上；鱼水重量比实验：分别在1∶5、1∶4、1∶3、1∶2下保活，其余条件同上。模拟运输台振动频率40 r/min，以静态试验组为对照组，分别在不同单因素实验条件下记录鱼的存活时长。
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图1 梯度降温暂养和模拟运输示意图 Fig. 1 Schematic diagram of gradient cooling temporary and simulated transportation |
利用Design-Expert12软件中的Box-behnken design (BBD)原理设计实验方案。根据单因素试验选取降温速率、温度和盐度作为试验因素，−1、0、1分别代表各因素的3个水平，以存活时时长为评价指标，研究珍珠龙胆石斑鱼保活运输的最佳低温保活运输工艺，试验方案如表1所示。
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表1 因素水平编码表 Tab. 1 Factor level coding table |
珍珠龙胆石斑鱼经梯度降温后转移至模拟运输振动台上(图1)温度15.7 ℃、盐度24‰的泡沫箱中，鱼水重量比为1∶5，振动台转速40 r/min，进行模拟运输试验。以原料鱼为对照组，分别在保活第0、3、12、24、48小时随机每个时间点抽取6尾样品从草鱼尾部静脉取血，全血不加抗凝剂，37 ℃恒温生化箱中静置0.5 h，待血液凝固分层后，以4 ℃、4000 r/min离心10 min，取血清于−80 ℃保存备用。
1.3.4 水质指标的测定在保活0、3、12、24、48 h时用多参数水质分析仪测定水质电导率、pH，水体中总氨氮浓度的测定参考金慧等[11]的方法，亚硝酸盐浓度的测定按照HJ/T 197-2005的方法[12]。
1.3.5 血清生化指标测定试验鱼每尾取500 μL血清，全自动生化分析仪测定葡萄糖(GLU)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)。其中，GLU含量的测定采用己糖激酶法，ALT、AST、AKP、LDH活性的测定采用速率法，ALT含量的测定采用溴甲酚绿法，TP含量的测定采用双缩脲法，TC采用胆固醇氧化酶法，TG采用比色法。血清中皮质醇(COR)含量采用酶联免疫法进检测。
1.3.6 肝脏抗氧化指标测定每条鱼收集(2.0± 0.1) g肝脏组织并放入50 mL离心管中，加入0.9%生理盐水18 mL，在冰上对组织进行均质，匀浆在4 ℃下3000 r/min，离心15 min，取上清液保存在−80 ℃下以待分析。肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)采用试剂盒进行测定，丙二醛(MAD)采用TBA法，超氧化物歧化酶(SOD)采用WST微板法，过氧化氢酶(CAT)采用钼酸铵法。
1.3.7 肝脏组织样片制备与读片石斑鱼肝脏组织样本用4%多聚甲醛溶液固定，固定的标本在流水下清洗，乙醇脱水，用二甲苯透明，嵌入石蜡并切片(切片厚度5~6 µm)。切片经HE染色、脱水并封装在中性树脂中，使用光学显微镜对组织结构进行观察拍照。
1.4 数据处理采用R软件(4.3.1版)的multcomp view包进行多重比较，通过ggplot2软件包进行可视化分析，结果以平均值±标准差($\bar x \pm {\rm{SD}}$)表示，组间差异通过单因素方差(one-way ANOVA)结合邓肯检验法进行比较分析，P<0.05认为差异显著。
2 结果与分析 2.1 各单因素对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响在静态和动态运输条件下，各因素对珍珠龙胆石斑鱼的存活时间影响的趋势基本一致，由图2所示，鱼体存活时间随温度升高呈先上升后下降的趋势，16 ℃下存活时间最长；低盐度和高盐度都不利于珍珠龙胆石斑鱼存活，在20‰~25‰盐度的水体中存活时间最长；比较降温速率发现，采用直接降温方式的石斑鱼的存活时间最短，0.5、1 ℃/h降温速率下的鱼体存活时间最长，降温速率加快，存活时间显著减低；鱼体的存活时间随鱼水重量比增大显著下降，鱼水重量比为1∶5时，静态暂养和模拟运输中石斑鱼的存活时间最长。通过单因素实验可知，温度在15~18 ℃，盐度15~25‰，降温速率在1.0~2.0 ℃/h，鱼水重量比越小越有利于延长活鱼运输时长，但降低鱼水重量比必然会增加运输成本。
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图2 温度(a)、盐度(b)、降温速率(c)和鱼水重量比(d)对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响不同字母表示组间存在显著性差异(P<0.05). Fig. 2 Effects of temperature (a), salinity (b), cooling rate (c), and weight ratio of fish to water (d) on the survival time of grouperDifferent letters indicate significant differences between groups (P<0.05). |
根据以上单因素试验结果，以降温速率(A)、温度(B)、盐度(C)为自变量，以鱼体存活时间为响应值，采用Box-Behnken试验设计，其结果如表2所示。
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表2 Box-Behnken 试验设计及结果 Tab. 2 Experimental design and results of Box-Behnken n=3; $\bar x \pm {\rm{SD}}$ |
以珍珠龙胆石斑鱼的存活时间(Y)为响应值，回归模型方程：Y=53−3.63A−1.62B−6.5C+0.5AB+ 0.75AC+0.25BC−3.75A2−3.75B2−11.5C2。
由表3可知，模型的F值为106.15，极显著(P<0.001)，失拟项为0.6426，不显著(P>0.05), R2= 0.9927, R2adj=0.9834，表明回归方程能够准确地拟合降温速率、温度、盐度对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响，可用来分析预测珍珠龙胆石斑鱼的低温保活运输工艺。A、C、A2、B2、C2值具有极显著性(P<0.001)。由F值可知三因素的影响顺序依次为：A=C>B，降温速率和盐度对存活时间的影响较大，温度对存活时间的影响较小。
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表3 响应面模型方差分析 Tab. 3 ANOVA for response surface model |
图3 是3个因素交互作用的影响，降温速率、温度和盐度之间的交互作用均不显著(P>0.05)。温度侧的响应面较盐度侧更缓，说明温度对石斑鱼存活时间的影响弱于盐度。降温速率侧的响应面较陡，说明降温速率对石斑鱼存活时间的影响较显著。因此，温度对石斑鱼存活时间的影响最小，这与前面的方差分析结果保持一致。等高线的形状可以反映交互作用的显著性，等高线呈椭圆形表示两因素交互作用显著。
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图3 各因素交互作用对石斑鱼存活时间影响的响应面图 Fig. 3 Responce surface plots of the effect of the interaction of factors on survival time of grouper |
采用Design-Expert 12软件分析得到的珍珠龙胆石斑鱼低温保活运输最佳工艺为：降温速率为1.234 ℃/h、温度15.738 ℃、盐度23.483‰，理论存活55.16 h。结合实验可操作性，将降温速率设定为1.2 ℃/h，温度设定为15.7 ℃，盐度设定为24‰。在1∶5鱼水重量比下进行模拟运输实验，珍珠龙胆石斑鱼的存活时间为(55.6±1.7) h，与理论结果比较相近，表明此响应面模型优化得到的珍珠龙胆石斑鱼低温保活运输工艺可靠。
2.3 模拟运输过程中水质指标的变化水质是保活运输中的关键因素，由图4可知，水体中总氨氮、亚硝酸盐浓度及电导率在运输过程中有大幅度上升趋势，pH虽有波动，但总体呈上升趋势。运输0~24 h内水体中总氨氮浓度增速与24~48 h相比较为缓慢，而亚硝酸盐浓度在0~24 h内迅速上升，24 h后迅速下降。水体的电导率随运输时间的延长呈缓慢增加的趋势。在运输过程中水体pH呈上升趋势，但其范围仍控制在6.5~8.5之间。
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图4 水质指标随运输时间的变化 Fig. 4 Variation of water quality indicators with transportation time |
珍珠龙胆石斑鱼在运输过程中受到多种因素的影响产生应激反应，通过各项血液生化指标可评估鱼体受到的应激程度大小。如图5所示，COR、GLU、ALT、AST、AKP和LDH活性总体上随运输时间延长呈先上升后下降趋势，各生化指标在运输3 h后显著上升，其中AST和ALT变化趋势一致。运输48 h后TG和TC含量显著下调，而ALB和TP含量先上升后下降。珍珠龙胆石斑鱼在受到急性低温胁迫后，SOD、CAT、GPX活性及MDA含量均上调，在3~48 h运输过程中，SOD、CAT和GPX活性随时间呈先上升后下降的趋势，而MDA含量呈先上升后下降再上升的趋势。
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图5 珍珠龙胆石斑鱼血清生化指标和肝脏氧化应激指标在不同运输时间的热图分析 Fig. 5 Heat map analysis of serum biochemical indexes and liver antioxidant stress indicators in grouper across different transportation times |
对珍珠龙胆石斑鱼的肝脏组织结构进行观察，如图6所示，对照组鱼的肝脏结构清晰，肝细胞排列紧密，少量肝细胞胞浆可见圆形空泡，静脉内皮完整正常，组织未见明显坏死或炎症反应。随着运输时间的延长，肝脏表现出不同程度和形式的损伤，与对照组相比，开始降温后较多肝细胞胞浆有圆形空泡，未见其他明显现象；运输3 h后，肝细胞肿胀，胞浆空白；运输12 h后，广泛见肝细胞肿胀，胞浆稀疏，并且在少量静脉周围可以看到炎性细胞灶性浸润；运输24 h后，细胞核失去了原有形态，细胞排列松散不规则，空泡消失；运输48 h后，肝细胞胞浆内含数量不等的圆形空泡，较多静脉周围肝细胞坏死，胞核溶解，胞浆浓缩，呈嗜酸性均质样，并且伴少量结缔组织增生。
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图6 运输过程中珍珠龙胆石斑鱼肝脏组织结构的变化a. 对照组；b. 0 h组；c. 3 h组；d. 12 h组；e. 24 h组；f. 48 h组. VS：空泡；LC：肝细胞；CV：静脉；N：细胞核；CT：结缔组织. Fig. 6 Changes in liver tissue structure of grouper during transportationa.Control group; b. 0 h group; c. 3 h group; d. 12 h group; e. 24 h group; f. 48 h group. VS: vacuole; LC: hepatocyte; CV: vein; N: nucleus; CT: connective tissue. |
在保活运输过程中，水质直接影响鱼的存活时间和运输效果。足够的氧气、适宜的温度、稳定的pH和氨氮含量等都是确保鱼类存活和运输效果的关键。本研究中，亚硝酸盐浓度呈先上升后下降的趋势，原因可能是硝化细菌在运输前期占据主导地位，氨氮被快速分解为亚硝酸盐等物质，而在运输24 h后，由于珍珠龙胆石斑鱼排放的含氮有机物在水中大量积累，导致反硝化细菌等迅速繁殖，造成水体中总氨氮含量迅速上升[13]。水中电导率可以帮助监测水体中的溶解物质含量，高电导率可能意味着水体中的盐度或溶解氧含量超过了鱼类所能耐受的范围。在整个运输过程中，水体的电导率呈缓慢增加的趋势，可能是由于珍珠龙胆石斑鱼在存活过程中会产生代谢产物，这些产物会导致水中盐分浓度增加，从而影响电导率升高，这与朱乾峰等[14]研究珍珠龙胆石斑鱼低温有水保活的结果相似。运输过程中pH维持在6.5~8.5，不会对鱼体造成较大程度的损伤[15]，因此该条件下水质pH的变化对石斑鱼存活时间影响不大。
3.2 模拟运输对珍珠龙胆石斑鱼应激反应的影响COR是在鱼类生理应激反应过程中产生的皮质类固醇激素，血液中皮质醇浓度可以作为衡量鱼应激强度的指标[16]。有研究发现COR的分泌能够促进鱼体内的蛋白质和糖原合成，同时加速脂肪降解，释放出氨基酸、葡萄糖和脂肪酸，从而提供机体所需的能量[17]。这种适应性生理反应可以帮助鱼类适应外界环境胁迫，并减缓应激反应带来的负面影响，例如免疫抑制、生长退化及存活率下降等。同时，环境温度、盐度和酸碱度等因素会显著影响COR的分泌和生理作用。鱼类在出现应激反应时，短期内会出现“高血糖”症状，为维持体内的GLU平衡，需通过糖异生作用提高体内的GLU水平[18]。GLU含量的升高主要是由儿茶酚胺和皮质醇分别激活肝脏糖异生和肌肉组织分解糖原引起，COR的分泌促进糖原的生成，从而使其血液中GLU水平升高[19]。本研究中珍珠龙胆石斑鱼在经历急性降温后，COR和GLU含量显著上调，说明急性降温和环境胁迫使鱼体产生应激反应，为适应外界的变化，鱼体内部大量糖原被分解为葡萄糖，以维持体内环境平衡[20]，这与Pilinkovskij等[21]对大西洋鲟在运输胁迫研究中血糖变化结果相似。正常情况下，鱼体血清中的ALT和AST活性较低且稳定，但是当肝脏、心脏等器官受到损伤或者发生病变时，这两种酶就会从细胞内渗出进入血液，从而使血液中的ALT和AST含量显著升高[22-23]。与对照组相比，ALT和AST含量在运输3 h后达到最高值，原因可能是珍珠龙胆石斑鱼受到振动刺激后，为了稳定内环境的平衡启动代谢补偿机制，同时应激反应对鱼体的肝脏等组织器官造成了一定的损伤[24]，这与Hoseini等[25]对鲤用姜黄缓解运输应激的研结果相似。TG和TC是鱼体内主要能量来源和细胞膜的重要组成部分[26]，运输48 h后TG和TC含量显著下调，表明鱼体的肝脏有所损伤，石斑鱼自身脂类等能量物质被分解，同时肝脏组织损伤严重，阻碍了甘油三酯通过肠肝循环途径再吸收到肝脏[27]。而ALB和TP含量先上调后下调则表明在低温应激下鱼体形成保护蛋白，而长时间运输之后，鱼体受到持续应激，造成不可逆性损伤，蛋白合成减少[28]。
3.3 模拟运输对珍珠龙胆石斑鱼抗氧化能力的影响SOD主要是清除细胞中生成的超氧自由基(O2–); CAT主要清除过氧化氢(H2O2); GPX主要清除细胞内外的过氧化脂质和有机过氧化物[29-31], MDA是由于脂质过氧化反应而生成的产物，其含量的高低可以反映细胞膜的氧化损伤情况。因此，评估SOD、CAT、GPX和MDA的含量及活性可以较全面地反映机体氧化损伤程度。本研究中珍珠龙胆石斑鱼在受到急性低温胁迫后，SOD、CAT、GPX活性及MDA含量均上调，说明石斑鱼受到应激后鱼体内部产生了大量活性氧自由基，需要较多的SOD、CAT、GPX酶活来清除体内过多的自由基。MDA含量呈先上升后下降再上升的趋势，原因可能是在24 h以内，鱼体在低温、饥饿和运输胁迫的影响下，肝脏中SOD、CAT和GPX活性增强以抵抗氧化应激，因此MDA含量迅速下降，但随着运输时间的延长，水体中氨氮、亚硝酸盐等有毒物质大量富集，使鱼体中毒导致抗氧化功能受损，体内活性氧自由基无法被及时清除，组织氧化损伤导MDA含量的迅速增加[32-33]。肝脏MDA含量在运输48 h后明显高于对照组，说明鱼体在运输过程中，肝脏氧化损伤程度不断加重，使细胞脂质过氧化反应加剧致MDA大量生成。
3.4 模拟运输对珍珠龙胆石斑鱼肝脏组织结构的影响肝脏是鱼体内重要的器官，具有能量代谢和脂肪酸供应等多种功能，利用能量可以对细胞进行修复和再生[34]。对照组的珍珠龙胆石斑鱼肝脏组织结构清晰，其中有少量的空泡，可能是鱼体需要能量，脂质分解为葡萄糖进行供能，导致了空泡的存在。经过降温后，圆形空泡增多，原因可能是珍珠龙胆石斑鱼在应激反应下的能量供应主要来自肝糖原或者脂肪的分解[35]。运输24 h时，细胞核形态发生变化，表明肝脏组织受损，同时肝细胞中的能量物质被氧化分解。在长时间运输下，肝脏的自我调节能力逐渐减弱，导致细胞核溶解，肝细胞坏死，此结果与区又君等[36]研究低温胁迫对四指马鲅幼鱼肝脏的损伤结果相似；表明低温运输使珍珠龙胆石斑鱼的肝脏受到损伤，并随着运输时间的延长而加深。
4 结论本研究通过单因素结合响应面试验优化了珍珠龙胆石斑鱼的低温保活运输工艺，最优运输条件为降温速率为1.2 ℃/h，温度为15.7 ℃，盐度为24‰，鱼水重量比为1∶5，此条件下珍珠龙胆石斑鱼在模拟运输的过程中存活时间最长，可达(55.6±1.7) h。血清COR含量在运输过程中呈先上调后下调的趋势，说明石斑鱼在运输过程中逐渐适应环境的变化。运输3 h时，ALT、AST、LDH活性和COR含量均达到最大值，并且鱼体出现了典型的高血糖现象，说明鱼体在此时的应激反应最为强烈，能量代谢显著增加。同时，剧烈的应激反应导致鱼体代谢废物的排放量增大，水体中氨氮、亚硝酸盐等有毒物质快速积累，为了抵御外界不利因素造成的氧化损伤，鱼体激活抗氧化酶(SOD、CAT、GPX)活性以清除体内的活性氧自由基。运输48 h时，水体中过量的氨氮、亚硝酸盐等物质破坏鱼体内部肝脏、肾脏等组织器官，肝脏无法维持正常的代谢功能和抗氧化功能，抗氧化酶(SOD、CAT、GPX)活性显著下降，脂质过氧化的最终产物MDA显著上调。同时，为了维持机体生命活动所需能量，石斑鱼自身糖原、脂肪等营养物质被大量分解，造成大量肝细胞出现空泡，血清中TP、TG、TC含量显著下降。
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