2024, Vol. 31 
2. 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306
3. 中科国生（杭州）科技有限公司，浙江 杭州 310000
2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
3. Zhongke Guosheng (Hangzhou) Technology Co., Ltd, Hangzhou 310000, China
近年来，水产养殖已成为全球粮食供给系统中增速最快的单元，鱼类是水产养殖的重要脊椎动物类群[1]。作为人类优质蛋白的重要来源，影响鱼类产品质量和产量的福利问题日益引起人们的重视[2]。为提高鱼类养殖福利水平，科研人员从植物、动物和微生物中提取出生物活性化合物作为绿色添加剂以改善生长性能或提高健康水平[3-4]。何勤等[5]给鲤(Cyprinus carpio)在饲料中添加1.0 g/kg的银杏提取物(GBE)可增强鲤的抗应激和抗氧化能力，提高免疫相关基因的表达。Harikrishna等[6]研究表明，在饲料中添加壳寡糖(COS)和海藻酸(AA)可以提高鲢(Hypophthalmichthys molitrix)生长性能，调节肠道微生物群平衡，提高抗氧化能力和免疫力。5-HMF (5-hydroxymethyl furfural, 5-羟甲基糠醛)是一种含有呋喃环结构的糠醛化合物，由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸条件下脱水产生[7-8]，广泛存在于食品[9-10]和中药[11]中。已经有研究报道5-HMF具有增加抗氧化活性[12-14]、抗炎[15-16]和调节肠道微生物区系[17]等多种功效。Li等[18]研究表明，给小鼠注射5-HMF可以通过恢复抗氧化酶含量保护酒精诱导的肝损伤。杨蒙[17]研究发现在犊牛饲料中添加不同浓度5-HMF产品，可起到提高机体免疫力和抗氧化能力，增强红细胞血红蛋白携氧能力，调节肠道微生物等作用。Abdulmalik等[19]研究得出5-HMF可以迅速从小鼠胃肠道吸收到血液中，透过红细胞膜与镰状细胞血红蛋白(HbS)结合，在较低浓度下可以抑制镰状细胞的形成。研究还发现将含有5-HMF的中草药添加到动物日粮中能提高鸡的生长性能，增强机体免疫力，改善鸡肉品质[20]。但目前尚未有5-HMF在水产养殖中应用的报道。
黄条鰤(Seriola aureovittata)隶属于鲈形目(Perciformes)、鯵科(Carangidae)、鰤属(Seriola)，是一种全球海域广泛分布的大洋性经济鱼类，具有长距离洄游特性[21]，由于其生长迅速、营养丰富、肉质鲜嫩等特点，全球消费需求持续增加[22]。黄条鰤是适宜深远海大型设施养殖的优良鱼种，自2017年苗种人工繁育技术突破以来，目前养殖产业已在山东、福建和辽宁兴起[23]。养殖生产实践中发现，黄条鰤对环境变化和人工操作的应激较强，容易引起生理应激从而影响生长甚至引发病害或死亡，因此有必要筛选或研发可用于增强养殖黄条鰤免疫机能和消减应激反应的绿色生物制剂，以提高健康养殖水平。本实验以黄条鰤为对象，通过在其饲料中添加不同浓度的5-HMF，探究其对黄条鰤生长性能、肠道组织结构、抗氧化和免疫生理特性、菌群结构等的调控作用。研究结果将为黄条鰤养殖应激消减绿色生物制剂研制和健康养殖技术开发提供理论支撑，也可为5-HMF在海水鱼健康养殖中的应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 不同浓度5-HMF对Caco-2细胞增殖的影响 1.1.1 细胞活性实验设计为确定适宜的饲料添加浓度，探究了不同5-HMF浓度对细胞的毒损作用，本实验选取不同浓度(0 mmol、1.6 mmol、3.2 mmol、6.3 mmol)的5-HMF干预Caco-2细胞(人结直肠腺癌细胞) 24 h, MTT法检测细胞活力情况。以1 mL DEME细胞培养液中加入0.01 mg待测样品配置待测母液，母液中5-HMF有效浓度为6.3 mmol/L，各实验组待测液配制及成分浓度见表1。
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表1 不同实验组待测液配制及成分浓度 Tab. 1 Preparation and component concentrations of test solutions for different experimental groups |
Caco-2细胞培养在含有5 mL的完全DMEM培养基(含有10%的胎牛血清和1%的青霉素、链霉素抗体)的T25细胞瓶中，培养在37 ℃、含5% CO2的恒温培养箱，每2天更换一次培养基。
待细胞生长至T25细胞瓶的90%左右时传代，传代时吸出培养瓶内原有培养基，用2 mL无菌PBS (1×)轻轻冲洗，吸出PBS后用胰酶(含0.25% EDTA)在37 ℃处理3 min，处理后加入2 mL完全α-MEM培养基中止消化，1000 g离心5 min后弃上清，后用1 mL完全α-MEM培养基重悬细胞，轻吹均匀后，取0.5 mL加入到新的含有4.5 mL的完全α-MEM培养基T25细胞培养瓶中，置于培养箱中继续培养。
1.1.3 5-HMF对Caco-2细胞活性的影响选取5-20代内的Caco-2细胞，以每孔1×104个的接种量接种至96孔板内培养24 h后，吸出孔内原有培养基后加入100 μL的含不同浓度待测5-HMF培养基(5-HMF溶解在不含有胎牛血清培养基中)，具体浓度为0 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL，在培养箱中培养20 h后，每孔加入10 Μlmtt (5 mg/mL)，在37 ℃环境下孵育4 h，将其吸出孔内培养基，加入150 μL DMSO，摇板15 min后于490 nm处测定其吸光度，细胞增殖活性按照如下公式计算：
细胞增殖活性=(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100%
式中，A空白是样品浓度为0 g/mL下的吸光度。
5-HMF由中科国生(杭州)科技有限公司提供；培养基及血清等均来自Biological Industries (Israel Beit Haemek Co., Ltd); MTT来自Sigma公司；Caco-2细胞来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所(上海)。
1.2 实验鱼来源实验于2021年9月至11月在大连富谷食品有限公司的工厂化养殖车间进行，实验周期为6周。实验所用黄条鰤来自该公司海上网箱基地养殖的体质健康、规格一致的6月龄幼鱼，平均体长(17.35±0.51) cm，平均体重(82.33±2.75) g。
1.3 饲料添加投喂实验设计与管理实验容器为3 m3圆形玻璃缸水槽，投喂基础饲料(林兼产业株式会社，主要成分：粗蛋白46%、水分11%、粗脂肪6%、粗灰分19%、钙1%、总磷1%、粗纤维4%、氨基酸1%)。实验开始前，实验鱼暂养7 d，期间投喂基础饲料，日投喂2次，分别在8:00和16:00按体重的2%进行投喂，实验开始前禁食24 h。挑选360条体格均一、平均体重(82.33±2.75) g实验鱼随机分4组(M0组、M1组、M2组、M3组)，每组3个重复，每个重复30尾实验鱼。饲料添加不同浓度的5-HMF，通过喷雾的方式均匀覆盖在饲料表面，进行低温烘干，将5-HMF附着在基础饲料上，制成实验饲料。M0组为对照组(投喂基础饲料), M1组、M2组、M3组分别投喂0.25%、0.5%、1% 5-HMF的实验饲料(添加量依据细胞活性实验评估确定)。实验鱼流水养殖，日换水率200%~300%。实验养殖条件：水温17~22 ℃，盐度31~32, DO>7 mg/L。
1.4 样品采集与处理实验结束后，采取24 h饥饿处理，对照组和实验组分别取样12尾实验鱼，用80 mg/L的MS-222进行麻醉，测量体长、体重。使用2 mL注射器从尾静脉采集血液样本，4 ℃静置，以4000 r/min离心10 min，分离上清液后储存于−80 ℃备用。解剖实验鱼取消化道(胃、幽门盲囊、肠道)样品，去除各组织周围的脂肪等组织并轻轻挤出消化道内残留的食糜，用预冷的灭菌生理盐水冲洗数次后，将消化道(胃、幽门盲囊、中肠)分装保存于液氮中，用于消化道菌群结构分析。利用Davis固定液，保存肠道样品，用于肠道组织形态特性分析。
1.5 指标测定 1.5.1 生长指标计算增重率(weight gain ratio, WGR, %)=[(Wt-W0)/W0]×100;
特定生长率(specific growth ratio, SGR, %/d)=[(lnWt-lnW0)/t]×100;
肥满度(condition factor, CF, g/cm3)=Wt/L3。
式中，W0、Wt分别为实验初始和结束平均鱼体重(湿重，g); t为实验天数(d); L为体长(cm)。
1.5.2 肠道组织结构分析取Davis固定的肠道样品，经过75%、80%、95%、100%梯度乙醇脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋与切片(厚度为5 μm)、苏木精-伊红(HE)染色后中性树胶封片，置于Pannoramic MIDI II数字切片扫描仪下观察，并拍照记录样本。使用Image J软件测量肠道肌层厚度、绒毛高度和杯状细胞个数。
1.5.3 血清抗氧化酶活力测定实验所用抗氧化酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，参照说明书测定血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH- PX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性，并测定丙二醛(MAD)浓度。
1.5.4 血清免疫相关酶活力测定免疫球蛋白M(IgM)、溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(AKP)及酸性磷酸酶(ACP)活性使用试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定，测定方法依照试剂盒说明书进行操作。
1.5.5 消化道微生物高通量测序按照DNA抽提试剂盒(MagPure Soil DNA KF Kit)操作说明提取消化道样本的基因组DNA，利用Nano Drop 2000和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度。以基因组DNA为模板，采用带barcode的特异引物Tks Gflex DNA Polymerase (Takara)进行PCR，使用引物343F (5ʹ-TACGGRAGGCAGCAG-3ʹ)和798R (5ʹ-AGGGTATCTAATCCT-3ʹ)扩增16S V3-V4区。琼脂糖凝胶电泳检测合格后的扩增序列可利用Illumina MiSeq PE300平台进行高通量测序。
1.6 数据统计与分析将微生物测序获得的原始图像数据文件经过碱基识别分析，使用FASTQ格式转化成原始测序序列，在剪切、去杂、拼接、质控和去除嵌合体后得到有效序列。根据序列相似性将其整合成多个可分类操作单元(OTU)，当相似度≥97%序列被归为一个OTU单元。使用QIIME软件筛选出每个OUT中丰度最大的序列，作为该OUT的代表序列，使用Silva (version123)数据库把所有代表序列对比注释，使用RDP classifier软件进行物种对比注释，保留置信区间大于0.7的注释结果。
使用Excel 2021对实验结果数据进行处理，均以平均值±标准差(SD)表示。数据统计分析采用SPSS 26.0软件，将不同浓度实验组的同一指标使用单因素方差分析(one-way ANOVA)并作Duncan多重比较，显著差异水平采用P<0.05。
2 结果与分析 2.1 5-HMF对Caco-2细胞增殖的影响不同浓度5-HMF实验组细胞增殖率均与对照组出现显著性差异(P<0.05)，但各实验组的细胞增殖率均大于85% (表2)，表明实验所使用的5-HMF浓度对细胞无明显生理毒损作用，实验所用5-HMF浓度处于安全范围，适宜作为饲料添加浓度。
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表2 不同浓度5-HMF对Caco-2细胞增殖的影响 Tab. 2 Effects of different concentrations of 5-HMF on the proliferation of Caco-2 cells n=6; $\bar x \pm {\rm{SD}}$ |
M2和M3组的增重率和特定生长率均显著高于M0和M1组(P<0.05)，其中以M3组的效果最好，而只有M2组肥满度显著高于M0组(P<0.05) (表3)。
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表3 5-HMF对黄条鰤幼鱼生长指标的影响 Tab. 3 Effects of 5-HMF on growth indexes of juvenile Seriola aureovittata n=12; $\bar x \pm {\rm{SD}}$ |
不同组黄条鰤肠道组织形态如图1所示。M2组实验鱼肠道肌层厚度和绒毛高度显著高于M0、M1和M3组(P<0.05)，杯状细胞数量最多但与其他组无显著差异(P>0.05)(表4)。
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表4 5-HMF对黄条鰤幼鱼肠道组织结构的影响 Tab. 4 Effects of 5-HMF on the histological and morphometric characteristics of the intestine of juvenile Seriola aureovittata n=6; $\bar x \pm {\rm{SD}}$ |
02-0185-12-F001.jpg "点击查看原图") |
图1 饲料中添加不同浓度5-HMF对黄条鰤肠道组织形态的影响 Fig. 1 Effects of different concentrations of 5-HMF on the intestinal morphology and histology of juvenile Seriola aureovittata |
与M0组相比，实验组实验鱼血清GSH-PX水平显著升高(P<0.05); M2、M3组血清SOD和CAT活性显著高于M0组(P<0.05)，但MAD水平显著低于M2、M3组(P<0.05)(表5)。
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表5 5-HMF对黄条鰤幼鱼血清抗氧化酶活性的影响 Tab. 5 Effects of 5-HMF on the serum antioxidant enzymes activities of juvenile Seriola aureovittata n=3; $\bar x \pm {\rm{SD}}$ |
M2和M3组实验鱼血清IgM和AKP显著高于M0和M1组(P<0.05); M2组LZM和ACP活性显著高于M0组(P<0.05)，但M3组的LZM和ACP水平显著低于M0和M1组(表6)。
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表6 5-HMF对黄条鰤幼鱼血清免疫相关酶活性的影响 Tab. 6 Effects of 5-HMF on serum immune related enzymes activities of juvenile Seriola aureovittata n=3; $\bar x \pm {\rm{SD}}$ |
以添加不同浓度5-HMF的饲料投喂黄条鰤幼鱼后，消化道微生物测序数据表明12个处理组的coverage指数均接近1，说明测序数据可靠(表7)。M0组幽门盲囊微生物Chao1指数显著高于M1组(P<0.05)。M2组肠道微生物的Shannon指数显著高于M0和M1组(P<0.05)。
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表7 5-HMF对黄条鰤幼鱼消化道菌群alpha多样性指数的影响 Tab. 7 Effects of 5-HMF on alpha diversity of the gastrointestinal bacteria of juvenile Seriola aureovittata n=3; $\bar x \pm {\rm{SD}}$ |
在门水平上，黄条鰤幼鱼消化道中的菌群丰度前5位为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和脱硫菌门(Desulfobacterota)。各实验组中拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的相对丰度均达到90%以上。在幽门盲囊中，M0组变形菌门和放线菌门相对丰度高于实验组，而拟杆菌门的相对丰度低于实验组(图2)。
02-0185-12-F002.jpg "点击查看原图") |
图2 基于门水平的黄条鰤幼鱼消化道微生物群落结构S、P、G分别为胃、幽门盲囊、肠道，M1、M2、M3表示不同实验组，M0为对照组. Fig. 2 Gastrointestinal microbial community structure based on phylum levelS, P and G represent the stomach, pyloric caecum and intestine of jurenile Seriala aureontta, respectively, while M1, M2 and M3 represent different experimental groups, M0 represents the control group. |
在属水平上，黄条鰤幼鱼消化道的菌群组成相似，主要是由拟杆菌属(Bacteroides)、Muribaculaceae、Lachnoclostridium、乳杆菌属(Lactobacillus)、副杆菌属(Parabacteroides)、回肠杆菌属(Ileibacterium)、Lachnospiraceae_NK4A136_group、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、普拉梭菌属(Faecalibaculum)等组成。与M0组相比，实验组的幽门盲囊中拟杆菌属和Muribaculaceae等优势菌属比例有所增加，而Escherichia-Shigella等致病菌属丰度下降。(图3)
02-0185-12-F003.jpg "点击查看原图") |
图3 基于属水平的消化道微生物群落结构S、P、G分别为胃、幽门盲囊、肠道，M1、M2、M3表示不同实验组，M0为对照组. Fig. 3 Gastrointestinal microbial community structure based on genus levelS, P and G represent the stomach, pyloric caecum and intestine of jurenile Seriala aureontta, respectively, while M1, M2 and M3 represent different experimental groups, M0 represents the control group. |
本研究表明利用不同浓度5-HMF处理Caco-2细胞后，细胞增殖率虽与对照组有显著差异但细胞增殖率仍大于85%，表明实验所使用的5-HMF浓度对细胞无明显生理毒损作用。Janzowski等[24]研究发现5-HMF对Caco-2细胞有弱毒性，但并没有观察到遗传毒性和DNA损伤作用，因此5-HMF即使达到细胞毒性浓度极限值(80 mmol/L)也不会对人类构成严重的健康风险。Abraham等[25]研究也发现给小鼠每天投喂添加量为80~100 mg/kg的5-HMF也没有观察到急性和亚急性中毒症状。
先前研究发现，5-HMF可提高脊椎动物红细胞变形能力，促进血液流动，显著改善血液循环[26]，使机体的生长和代谢活动增加，提高动物生长性能。如给牛、羊添加含有5-HMF的中草药可以提高其生长性能和免疫能力[27-28]。本研究发现，在饲料中添加适量5-HMF能够促进黄条鰤生长，随着饲料中5-HMF添加量的增加，实验鱼增重率和特定生长率呈升高趋势，同时也不同程度提高了黄条鰤的肥满度，表明5-HMF可能在生长代谢方面起到了重要的调控作用，这也是5-HMF在促进鱼类养殖生长机能方面的首次应用报道，具体的机理有待于进一步研究探索。
肠道是鱼类消化和营养吸收的主要器官，其形态结构对于鱼类生长发育至关重要[29]，肌层越厚，肠道绒毛越高，营养物质吸收能力和消化利用率越高[30-31]。本研究发现，实验鱼肠道的肌层厚度、绒毛高度和杯状细胞数目均高于对照组，其中以M2组的效果最为明显，表明饲料中添加5-HMF改善了实验鱼的肠道组织结构，促进了营养物质吸收和利用，且具有剂量依赖效应。有研究指出肠道微生物群可以通过促进血管形成、绒毛厚度增加、黏液产生等驱动肠道发育[32]，推测5-HMF诱导益生菌产生短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)等代谢物质，对肠道绒毛增殖和修复起促进作用，具体的作用途径及可能的机理有待于进一步探究。
鱼类抗氧化功能是将机体内因代谢异常而产生多余的活性氧(ROS)清除，从而维持机体抗氧化和氧化能力平衡[33-34]。SOD通过将机体产生多余的O2-转化为H2O2来消除超氧阴离子自由基[35], CAT可以催化H2O2分解成H2O和O2，还能抑制H2O2转化成·OH[36]。GSH-Px能够阻止自由基对磷脂膜和其他分子的损害[37]。本研究发现，M2和M3组实验鱼血清中SOD、CAT和GSH-Px活性显著高于M0和M1组，表明饲料中添加0.5%以上的5-HMF可有显著提高黄条鰤幼鱼抗氧化相关酶活水平，有效应对过氧化反应引发的ROS和自由基损伤，从而提升机体抗氧化性能。同时，M2组GSH-Px酶活水平最高，表明0.5%的HMF饲料添加量对于机体自由基损伤的防护作用最佳。血清MDA浓度反映了机体活性氧自由基的水平[38]。笔者也发现使用添加了0.5%和1%的5-HMF的饲料后，实验鱼血清中MDA含量浓度显著下降，表明饲料中添加一定量的5-HMF有效降低了脂质过氧化物的积累，从而起到对组织过氧化效应的保护作用。先前研究发现，在高脂饲料中添加5-HMF，可以显著提高小鼠中血浆CAT活性，并显著降低MDA含量[39]。赵玲[38]的研究表明，5-HMF通过增加抗氧化能力和抑制促炎因子的表达，从而延缓肝脏细胞的损伤，同时可以提高抗氧化酶的含量起到抗DNA氧化损伤的作用。这些与本研究结果相似，但5-HMF对鱼类抗氧化机能的提升是否与哺乳动物相似尚有待于深入研究确证。
鱼体抵御病原菌的侵害时，体内的非特异性免疫系统率先发挥作用[40]。IgM有杀菌、免疫调理和激活补体等作用[41]，对犊牛研究表明在饲料中添加5-HMF可显著提高血清中免疫球蛋白含量从而调节免疫机能[17]。本研究也发现，M2和M3组实验鱼血清中的IgM活性显著高于M0组，表明5-HMF的摄入提升了黄条鰤幼鱼应对病原菌入侵的能力和免疫水平。ACP和AKP是溶酶体的重要标志酶，参与机体内信号传导和磷酸酯代谢等功能调节[42]。LZM可以将细菌细胞壁上的黏多糖溶解，从而发挥重要的免疫作用[43]。笔者发现M2组的血清LZM活性以及ACP和AKP活性均显著高于M0组，表明5-HMF提升了黄条鰤幼鱼血清中免疫相关酶的活性，提高了机体免疫信号转导和应对病原菌侵害的能力，从而提高了免疫机能，具体的作用途径和机理尚有待于进一步验证。
消化道微生物会显著影响宿主机体的生理代谢过程[44]，对水产养殖动物健康起着重要的调控作用。在本研究中，M0组实验鱼幽门盲囊中微生物chao1指数显著高于M1组，而在肠道组织中，M2组实验鱼微生物的shannon指数显著高于M0和M1组，说明饲料中添加5-HMF可以改变黄条鰤消化道内菌群的结构及多样性。本研究还发现，在饲料中添加不同浓度5-HMF后，黄条鰤幼鱼消化道菌群虽然在门和属水平上种类的组成相似且不存在显著性差异，但实验组实验鱼幽门盲囊中拟杆菌属和Muribaculaceae等优势菌属比例有所增加，而Escherichia-Shigella等致病菌属丰度下降。拟杆菌属有助于消化食物并给寄主提供所需的能量和营养，还能促进其他菌群的生长以保持消化道内菌群平衡[45], Muribaculaceae属于S24-7家族，涉及复杂的碳水化合物降解[46]。由此，可初步推断饲料中添加5-HMF改善了黄条鰤幼鱼肠道菌群的结构，并对肠道中营养消化和能量供给相关菌群结构起到了积极的优化作用，并对潜在致病菌的丰度起到了抑制调控作用。下一步，将从5-HMF与消化道中其他微生物的互作机制方面进行深入研究，以期为阐释5-HMF在黄条鰤消化道微生态健康调控中的作用和科学的应用提供更深层面的理论支撑。
4 结论综上所述，在饲料中添加5-HMF实验饲料有利于提升黄条鰤幼鱼的生长性能，提高血清免疫和抗氧化相关酶活力，对肠道组织形态和消化道菌群结构也起到一定的优化调节作用。基于本研究结果，综合肥满度、肠道结构指标、消化道菌群及血清GSH-Px、CAT、SOD、LZM、IgM、ACP等酶活水平数据，认为在本实验条件下在饲料中添加0.5%浓度的5-HMF对黄条鰤幼鱼的生长和生理特性调控效果最佳，结果可为黄条鰤绿色饲料添加剂研制和健康养殖技术开发提供科学依据。
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