中国水产科学  2024, Vol. 31 Issue (03): 241-256  DOI: 10.12264/JFSC2023-0347
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引用本文 

华吉祥, 陶易凡, 李岩, 王庆春, 陈文华, 诸葛燕, 张茂友, 董亚伦, 路思琪, 姜冰洁, 强俊. 基于RAD-seq的大口黑鲈选育群体快长SNP挖掘及其与生长性状的关联分析[J]. 中国水产科学, 2024, 31(3): 241-256. DOI: 10.12264/JFSC2023-0347.
HUA Jixiang, TAO Yifan, LI Yan, WANG Qingchun, CHEN Wenhua, ZHUGE Yan, ZHANG Maoyou, DONG Yalun, LU Siqi, JIANG Bingjie, QIANG Jun. Development of fast-growth SNP screening and association analysis with growth traits based on RAD-seq for largemouth bass (Micropterus salmoides) breeding populations[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2024, 31(3): 241-256. DOI: 10.12264/JFSC2023-0347.

基金项目

国家重点研发计划项目（2022YFE0139600）；科技创新2030-重大项目（2023ZD04065）；苏州市科技计划项目（SNG2021009）；江苏省种业振兴“揭榜挂帅”项目（JBGS[2021]130）；加州鲈产业重大技术协同推广计划项目（2022-ZYXT-07）；中国水产科学研究院淡水渔业研究中心基本科研业务费项目（2023JBFR02）.

作者简介

华吉祥（1998‒），男，硕士，研究方向为水产生物技术. E-mail：huajixiang@ffrc.cn

通信作者

通信作者：强俊，研究员，研究方向为水产生物技术. E-mail：qiangj@ffrc.cn

文章历史

收稿日期：2023-12-19
修改日期：2024-02-18
Contents              Abstract              Full text             Figures/Tables             PDF
基于RAD-seq的大口黑鲈选育群体快长SNP挖掘及其与生长性状的关联分析
华吉祥1,2,陶易凡2,李岩1,2,王庆春1,陈文华3,诸葛燕3,张茂友3,董亚伦2,路思琪2,姜冰洁2,强俊1,2,     
1. 南京农业大学无锡渔业学院，江苏　无锡　214081
2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村部淡水渔业与种质资源利用重点实验室，江苏　无锡　214081
3. 苏州市水产技术推广站，江苏　苏州　215004
收稿日期：2024-12-19；修改日期：2024-02-18
基金项目：国家重点研发计划项目（2022YFE0139600）；科技创新2030-重大项目（2023ZD04065）；苏州市科技计划项目（SNG2021009）；江苏省种业振兴“揭榜挂帅”项目（JBGS[2021]130）；加州鲈产业重大技术协同推广计划项目（2022-ZYXT-07）；中国水产科学研究院淡水渔业研究中心基本科研业务费项目（2023JBFR02）.
作者简介：华吉祥（1998‒），男，硕士，研究方向为水产生物技术. E-mail：huajixiang@ffrc.cn.
摘要：大口黑鲈（Micropterus salmoides）生长性状是衡量品质与产量的重要标准，开发快长SNP标记与挖掘优势基因型及生长主效基因，有助于进一步解析其生长发育遗传机制，为选育优质高产新品系奠定基础。基于简化基因组测序技术（restriction-site associated DNA sequencing，RAD-seq），在大口黑鲈美国北方亚种F0生长性状极端群体（体重极大前1%和极小后1%）中，筛选了与生长性状存在潜在关联的SNP位点，利用一般线性模型（generalized linear model，GLM）将SNP位点基因型与230尾F0个体的体重、体长、体高和体厚进行相关性分析，此外通过基因注释信息预测生长候选基因，并结合优势基因型加性效应分析优势基因型聚合效果。在大口黑鲈23条染色体上发现了4196486个高质量SNPs，基于种群特异基因型频率阈值0.7，初步筛选出100个与生长性状潜在相关的SNP位点。关联性分析显示，有12个SNP标记存在显著关联，包括5个标记与体重显著关联，10个与体长显著关联，4个与体高显著关联，5个与体厚显著关联。其中标记SNP19140160、SNP24406191、SNP3355498和SNP9244620分别定位至生长候选基因fam174b、diaph2、kiaa1549lb和ppip5k1b上。富集6~10个优势基因型的群体较富集0~5个优势基因型的群体在平均体重、体长、体高和体厚上分别提高了32.07%、9.63%、9.96%和10.58%。本研究所鉴定的12个快长SNP标记和4个生长候选基因可助力大口黑鲈生长性状改良。
关键词：大口黑鲈    简化基因组测序    SNP    生长性状    优势基因型    
Development of fast-growth SNP screening and association analysis with growth traits based on RAD-seq for largemouth bass (Micropterus salmoides) breeding populations
HUA Jixiang1,2,TAO Yifan2,LI Yan1,2,WANG Qingchun1,CHEN Wenhua3,ZHUGE Yan3,ZHANG Maoyou3,DONG Yalun2,LU Siqi2,JIANG Bingjie2,QIANG Jun,1,2    
1. Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081, China
2. Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China
3. Suzhou Aquatic Technology Extension Station, Suzhou 215004, China
Abstract:Growth traits in largemouth bass (Micropterus salmoides) are crucial indicators of quality and yield. The development of growth single nucleotide polymorphism (SNP) markers and exploration of dominant genotypes and growth genes will enhance our understanding of the genetic mechanisms underlying growth and development. Moreover, this research will facilitate the selection and breeding of new populations with exceptional growth traits. Using restriction site-associated DNA sequencing (RAD-seq), we conducted SNP screening in the F0 generation of the northern subspecies of largemouth bass, focusing on extreme groups with very high body weights (top 1%) and very low body weights (bottom 1%). A general linear model (GLM) was applied to establish correlations between the SNP genotypes and four growth traits (body weight, body length, body height, and body thickness) in a cohort of 230 F0 individuals. Additionally, candidate genes associated with growth were predicted using gene annotation information, and the combined additive effects of the dominant genotypes were analyzed through examination of their aggregation. A total of 4196486 high-quality SNPs were identified across 23 chromosomes of the largemouth bass. Using a population-specific genotype frequency threshold of 0.7, we initially screened 100 potential SNP loci related to growth and identified 12 that were significantly associated with growth. Specifically, five SNPs were significantly associated with body weight, 10 SNPs were significantly associated with body length, four SNPs were significantly associated with body height, and five SNPs were significantly associated with body thickness. Notably, the candidate growth genes fam174b, diaph2, kiaa1549lb, and ppip5k1b were linked to specific SNP markers including SNP19140160, SNP24406191, SNP3355498, and SNP9244620, respectively. The enrichment of 6−10 dominant genotypes resulted in an average increase of 32.07% in body weight, 9.63% in body length, 9.96% in body height, and 10.58% in body thickness compared to the enrichment of 0–5 dominant genotypes, significantly improving the effect of genotype enrichment. The 12 fast-growth SNP markers and four candidate growth genes identified in this study could assist in the improvement of growth traits in largemouth bass.
Key words： Micropterus salmoides     RAD-seq    SNP    growth traits    dominant genotypes    

大口黑鲈(Micropterus salmoides)原产于北美，20世纪80年代引入国内，因其生长速度快、适应性强、肉质鲜美而深受消费者喜爱。近年来大口黑鲈养殖产量逐年提升，2022年大口黑鲈养殖产量达80.2万t，较2021年的70.2万t增幅14.3%[1]。然而，伴随养殖产业不断发展，种质资源退化、抗病能力下降、优质苗种获取困难等问题日益增多，严重阻碍产业健康发展[2-3]。因此，系统开展大口黑鲈的良种保存和选育工作是解决目前大口黑鲈亲本品质退化的重要途径。

在鱼类养殖生产中，生长相关性状是衡量养殖成效的重要指标。鱼类的生长发育极为复杂，受基因、环境及其相互作用共同影响[4]。基因是影响鱼类生长发育的内在因素，目前在草鱼(Ctenopharyngodon idella)[5]，鳙(Hypophthalmichthys nobilis)[6]，大黄鱼(Larimichthys crocea)[7]和金鲳(Trachinotus ovatus)[8]等重要经济水产动物上均已鉴定出与生长相关的基因。在大口黑鲈中，通过候选基因法，筛选了众多与生长发育和代谢相关的基因，如热休克因子结合蛋白(HSBP1)、组织蛋白酶B (CTSB)、垂体特异性转录因子(POU1F1)、胰岛素样生长因子-1 (IGF-I)和载脂蛋白A1 (ApoproteinA1)等[9-13]。温度、溶氧、光照等环境因子是影响鱼类生长发育的外部因素[14-16]。

传统的良种选育结合分子标记辅助育种(marker assisted selection, MAS)，极大地加快了育种进程，因其具有更高的准确性，在水产动物育种中已被广泛运用[17]。SNP标记在基因组中具有位点分布广、密度高、遗传稳定等优势，已成为遗传学领域最为流行的分子标记之一[18]。目前，鱼类与生长相关的SNP标记被广泛发掘。孙雪等[19]基于不同生长速率的草鱼群体转录组数据，筛选了4个候选SNP标记。苗亮等[20]通过对光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus) MSTN基因的克隆，并检测其在不同组织中的表达情况筛选了10个生长相关SNP标记。近年来，由于简化基因组测序技术具有文库构建简单快速、准确性高等优点，在鱼类生长相关SNP标记开发中更具优势。通过简化基因组测序，在比目鱼(Paralichthys olivaceus)[21]、橙点石斑鱼(Epinephelus coioides)[22]、红尾鲇(Hemibagrus wyckioides)[23]中均筛选到生长相关SNP标记。通过SNP标记与生长性状进行关联性分析，探讨表型与功能等位基因的联系，有助于理解优势基因型聚合效果，这为下一步开展分子标记辅助育种提供支撑。周晓敏等[24]通过一般线性模型(generalized linear model, GLM)对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenber-gii) 5个生长性状进行相关性分析，找到4个显著关联的SNP标记。Zhang等[25]基于黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)的转录组数据，在60个基因分型成功的SNP中发现4个标记与体重显著关联，可用于生产实践。

本实验基于2020年从美国引种的3000尾大口黑鲈北方亚种构建的F0基础种群，通过简化基因组测序技术，筛选大口黑鲈快长SNP标记，挖掘优势基因型，为其种质改良奠定基础。

1　材料与方法 1.1　实验材料

本实验以引进种P0为亲本构建的F0基础种群为对象，在中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉基地饲养，养殖期间保持水体溶氧高于6 mg/L，氨氮低于6 mg/L, pH保持在7.7，于每天8:00和17:00使用鲈鱼专用商品饲料投喂。在相同养殖条件下，从3000尾鱼中挑选30尾极大个体，平均体重(724.2±119.2) g和30尾极小个体，平均体重(307.2±107.7) g。所有实验鱼均用MS-222 (200 mg/L)麻醉，剪取0.5 g尾鳍，立即置于液氮中冷冻，并在−80 ℃中保存备用。

1.2　DNA提取及dd-RAD文库构建和测序

使用DNA提取试剂盒(诺唯赞生物技术有限公司)从尾鳍样本中提取基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000超微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度。将基因组DNA稀释至50~70 ng/μL，保存在−20 ℃。采用限制性内切酶Hind III和Mse I组合对全基因组DNA进行完全酶切，回收插入一定长度的酶切片段，利用二代测序技术(next-generation sequencing, NGS)，基于Illumina NovaSeq测序平台，对文库进行2×150 bp双末端测序(派森诺，上海，中国)。使用fastp (v0.20.0)滑动窗口法对原始数据进行过滤，生成高质量序列。

1.3　全基因组SNP筛查

采用bwa-mem (0.7.12-r1039)程序将过滤后的高质量数据对比大口黑鲈参考基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Micropterus+ salmoides, PRJNA640112)，按照bwamem的默认参数比对。采用GATK软件进行SNP的检测，为保证SNP位点的可靠性，按照Zhu等[26]过滤标准对SNP进一步过滤。

1.4　群体亲缘关系分析

采用GCTA软件根据SNP数据去除次等位基因频率(MAF)<5%的SNP位点，对30尾快长个体和30尾慢长个体进行主成分分析(PCA)。群体亲缘关系分析通过状态同源IBS矩阵(plink v1.9)和全基因组关系矩阵(Gmatrix Ver2)计算完成。

1.5　快长群体特异性SNP筛选

采用派森诺生物技术有限公司自制脚本进行快长群体特异性SNP筛选。根据SNP位点在快长和慢长群体内4种基因型(0/0纯合基因型；0/1杂合基因型；1/1纯合的基因型；./.为位点缺失)出现的频率，设定种群特异基因型频率的阈值，如果在快长群体中该基因型个体出现的频率>阈值，且慢长群体中该基因型个体出现的频率<(1−阈值)，则该基因型为快长群体的特异基因型。本研究设定种群特异基因型频率的阈值为0.7。

1.6　基因分型检测与生长性状关联性分析

为验证实验1.5中筛选的SNP位点，在除了用于简化基因组测序的60尾鱼的另外2940尾鱼中随机收集230尾1龄F0大口黑鲈北方亚种个体，分别测量体重、体长、体高和体厚4个生长性状。按照1.1中的方法，剪取尾鳍，使用高通量Hi-SNP分型技术，采用Primer3.0软件对初筛的SNP位点设计特异性扩增引物，完成基因分型检测。采用TASSEL软件将SNP基因型和生长性状导入，利用一般线性模型进行关联分析，对生长性状关联定位。采用SPSS 22.0以SNP位点的基因型为自变量，不同性状值为因变量，进行差异显著性检验，显著性水平P<0.05，则认为该位点与性状显著关联。

1.7　SNP位点遗传多态性分析

采用Powermarker和PopGene32软件，计算与生长性状显著关联SNP位点在总群体中的遗传多样性指数，包括观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态性信息含量(PIC)、哈温平衡常数(HWE)、Nei’s遗传多样性指数(H)等。

1.8　生长候选基因预测

采用ANNOVAR软件对显著关联的SNP位点进行注释，利用已公布的大口黑鲈基因组测序数据库，将SNP位点与大口黑鲈基因组进行BLAST比对，定位基因组位置，并在SNP位点侧翼序列200 kb范围内提出候选基因。

1.9　统计分析

采用Excel 2021录入生长数据，并用SPSS22.0软件进行正态分布检验，符合正态分布的性状方可用于后续关联性分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行显著性差异分析，采用LSD进行多重比较，显著水平为0.05。实验结果均以平均值±标准差($\bar x \pm {\rm{SD}}$)表示。通过GraphPad Prism 9.0和Origin 2022软件绘图。

2　结果与分析 2.1　测序数据及全基因组SNP统计

基于dd-RAD测序，通过质量控制后，快长群体共获得高质量reads 252315516个，Q30为92.08%；慢长群体共获得高质量reads 238299380个，Q30为92.28%。快长群体获得reads数更多，两群体的平均GC含量相似，均为43.4%。对比参考基因组显示，两群体对比率均为99.82%。简化基因组测序结果统计，快长群体共检测到2080471个SNP，平均每尾69349个，慢长种群共检测到2116015个SNP，平均每尾70533个，慢长群体的SNP检出率高于快长群体，转换与颠换(Ts/Tv)之比为1.27。这4196486个SNP位于大口黑鲈23条基因组序列上(图1a)，以0.5 Mb为窗口统计SNP的数目，结果发现在NW_024040040.1基因组序列上聚集最多的SNP。

图1 　SNP与群体亲缘关系分析结果a. SNP在23条染色体上的分布；b. 快长慢长种群主成分分析；c. IBS遗传距离矩阵热图；d. 全基因组亲缘关系矩阵热图. Fig. 1 　Results of SNP and kinship analysis of populationa. Distribution of SNPs across 23 chromosomes; b. Principal component analysis of fast- and slow growth populations; c. IBS genetic distance matrix heat map; d. Genome-wide kinship matrix heat map.
2.2　群体亲缘关系分析结果

30尾极大个体和30尾极小个体大口黑鲈主成分分析结果显示，两个群体表现出相似的聚类模式，属于相同的亚群(图1b)，个体之间遗传距离范围为0~0.215 (图1c)，亲缘关系矩阵G值范围为0.326~1 (图1d)，个体间亲缘关系变化范围不大。总体而言，两群体分化水平不高，亲缘关系相近，适合用于快长SNP标记的开发。

2.3　快长群体特异性SNP筛选结果

根据本研究的2个群体差异性SNP筛选标准，共筛选出100个快长SNP位点，关联性分析结果显示，共12个SNP位点与生长性状显著关联(表1)。其中5个与体重显著关联，10个与体长显著关联，4个与体高显著关联，5个与体厚显著关联，与体长显著关联的SNP位点最多，与体高显著关联的SNP位点最少。其中位点SNP38891697和SNP19140160分别与体重、体长、体高和体厚均显著关联，位点SNP24406191和SNP4710104也分别与3个生长性状显著关联，位点SNP480436654与体高和体厚性状显著关联，位点SNP9519393与体重和体长性状显著关联，位点SNP23355498、SNP33992108、SNP9639603、SNP9639605、SNP17586389和SNP9244620均只与1个生长性状显著关联。12个SNP位点主要分布在7条基因组序列上，其中序列NW_024044237.1上分布的SNP位点最多，为3个，序列NW_024040485.1、NW_024044348.1和NW_024044570.1上均分布2个SNP位点，序列NW_024040040.1、NW_024041150.1和NW_024044681.1上均只分布1个SNP位点(图2)。12个SNP位点解释了2.7%~6.32%的表型变异，其中位点SNP38891697解释的表型变异最高为6.32%。

表1 　大口黑鲈生长性状与12个SNP位点关联性分析 Tab. 1 　Correlation analysis of the twelve SNP loci with growth traits of Micropterus salmoides
图2 　12个SNP位点在大口黑鲈基因组序列上的分布情况 Fig. 2 　Distribution of the twelve SNP loci over the genomic sequences of Micropterus salmoides
2.4　快长SNP标记多态性分析结果

12个SNP标记遗传多态性结果显示，遗传多态信息含量(PIC)介于0.12~0.35之间，平均PIC值为0.29，其中位点SNP24406191、SNP9519393和SNP17586389为低多态性位点(PIC<0.25)，其余所有位点均为中度多态性位点(PIC>0.25)。观测杂合度(Ho)为0.13~0.50，期望杂合度(He)为0.13~ 0.26，有效等位基因数(Ne)为1.14~1.184，平均群体Nei’s遗传多样性指数(H)为0.36，表明所选用的大口黑鲈群体具有较为丰富的遗传多样性。其中位点SNP4710104偏离哈温平衡状态(P<0.05)，其余11个位点均符合哈温平衡状态(P>0.05)(表2)。

表2 　12个SNP位点在大口黑鲈群体中的遗传多态性 Tab. 2 　Genetic polymorphism of 12 SNP loci in Micropterus salmoides population
2.5　SNP标记与大口黑鲈生长性状关联性分析结果 2.5.1　大口黑鲈生长性状数据统计

通过对230尾用于关联系分析的大口黑鲈体重、体长、体高和体厚等性状进行统计分析(表3)，各性状数值均呈正态分布(图3)，体重变异幅度为246~1261，平均值为624.5 g，变异系数最大为27.2%；体厚变异幅度为3.6~7.1，平均值为5.1 cm，变异系数次之为11.4%；体长变异幅度为19.8~32.7平均值为25.6 cm，变异系数最小为8.8%；体高变异幅度为7.1~11.4，平均值为8.7 cm，变异系数为9.7%。4个生长性状均表现出广泛的表型变异，变异范围为8.8%~27.2%。

表3 　用于关联性分析的230尾大口黑鲈生长性状统计 Tab. 3 　Summary of growth data for the Micropterus salmoides (n=230) used for the association analysis
图3 　大口黑鲈4个生长性状的频率分布 Fig. 3 　Frequency distribution of four growth traits of Micropterus salmoides
2.5.2　SNP标记不同基因型与大口黑鲈生长性状相关性分析

12个SNP标记不同基因型所对应的生长性状结果见表4，标记SNP38891697的CC基因型、SNP19140160的AA基因型、SNP23355498的GG基因型、SNP33992108的AT基因型、SNP48043665的CT基因型、SNP9519393的AT基因型和SNP9244620的AA基因型个体在体重、体长、体高和体厚4个性状上均为最高值。其中标记SNP38891697的CC基因型、SNP19140160的AA基因型和SNP48043665的CT基因型在体重、体长、体高和体厚4个性状上分别与GG基因型、CC基因型和CT基因型存在显著差异(P<0.05)，标记SNP23355498的GG基因型和SNP33992108的AT基因型在体重、体长和体高3个性状上分别与AG基因型和TT基因型存在显著差异(P<0.05)，标记SNP9244620的AA基因型仅在体高和体厚2个性状上与TT基因型存在显著差异(P<0.05)。标记SNP4710104的CC基因型、SNP9639603的GG基因型、SNP9639605的AA基因型和SNP17586389的AG基因型个体在体重、体长和体高3个性状上均为最高值。其中标记SNP9639603的GG基因型和SNP9639605的AA基因型仅在体长上分别与GT和AT基因型存在显著差异(P<0.05)。标记SNP24406191的CC基因型个体在体重和体高性状上最高，且与CT基因型存在显著差异(P<0.05)，在体长和体厚性状上TT基因型更高。

表4 　12个SNP标记不同基因型与大口黑鲈生长性状的相关性分析 Tab. 4 　Correlation analysis of different genotypes of the twelve SNP markers with growth traits of Micropterus salmoides

统计12个SNP标记不同基因型所对应的生长性状分布(图4)，以标记SNP19140160的体重为例，具有AA基因型个体的体重中位线在652 g处，AC基因型在623 g处，CC基因型在534 g处，AA基因型处在中位线上的个体较多，且群体体重极大值也在基因型AA上。而标记SNP9519393的AA基因型个体只有1尾，TT基因型个体最多，其体重和体长中位线分别在614 g和25 cm处。

图4 　12个SNP标记不同基因型对应大口黑鲈生长性状分布a. SNP38891697-体重，体长，体高，体厚. b. SNP19140160-体重，体长，体高，体厚. c. SNP24406191-体重，体长，体厚. d. SNP23355498-体长. e. SNP4710104-体重，体长，体高. f. SNP33992108-体长. g. SNP48043665-体高，体厚. h. SNP9639603-体长. i. SNP9639605-体长. j. SNP9519393-体重，体长. k. SNP17586389-体长. l. SNP9244620-体厚. Fig. 4 　Distribution of growth traits of Micropterus salmoides corresponding to different genotypes of the twelve SNP markersa. SNP38891697-body weight, length, height, thickness. b. SNP19140160-body weight, length, height, thickness. c. SNP24406191-body weight, length, thickness. d. SNP23355498-body length. e. SNP4710104-body weight, length, height. f. SNP33992108-body length. g. SNP48043665-body height, body thickness. h. SNP9639603-body length. i. SNP9639605-body length. j. SNP9519393-body weight, body length. k. SNP17586389-body length. l. SNP9244620-body thickness.
2.5.3　SNP标记加性效应与优势基因型统计

进一步统计各SNP标记所具备的加性效应与优势基因型，根据加性效应计算公式[等位基因A加性效应=(AA−BB)/2], A为高表型值等位基因，B为低表型值等位基因，AA为A的纯合基因型，BB为B的纯合基因型，4个生长性状的加性效应见图5。与体重显著关联的5个SNP标记中，SNP38891697和SNP19140160加性效应突出，分别为63.8 g和58.9 g, SNP24406191最低，仅为6.9 g；与体长显著关联的10个SNP标记中，加性效应突出的是SNP38891697、SNP19140160、SNP4710104和SNP33992108，其中SNP38891697的加性效应最高，为0.67 cm, SNP24406191最低，为0.03 cm；与体高显著关联的4个SNP标记中，标记SNP19140160加性效应最高，为0.39 cm, SNP4710104最低，为0.04 cm；与体厚显著关联的5个SNP标记中，标记SNP19140160加性效应同样最高，为0.20 cm, SNP48043665最低，为0.03 cm。标记SNP38891697和SNP19140160在体重、体长、体高和体厚上均具有更好的加性效应，可作为主效标记。

图5 　大口黑鲈4个生长性状对应SNP标记的加性效应 Fig. 5 　Additive effects of SNP markers corresponding to four growth traits of Micropterus salmoides

同时，本研究统计了12个SNP标记的优势基因型(图6a)，代表个体所在基因型最高的生长性状。其中标记SNP24406196体重的优势基因型为CC基因型，体长和体厚的优势基因型为TT基因型。标记SNP48043665体高和体厚的优势基因型为杂合CT基因型，SNP9519393体重和体长的优势基因型为杂合AT基因型，SNP33992108和SNP17586389体长的优势基因型分别为杂合AT和AG基因型。其余SNP标记的优势基因型均为纯合基因型。将SNP标记优势基因型与所对应的生长性状加性效应进行关联性分析(图6b)，其中标记SNP38891687、SNP19140160、SNP9519393和SNP4710104在体重上关联性更高，体重可作为重点改良性状。

图6 　大口黑鲈12个SNP标记优势基因型及性状关联统计a. 12个SNP标记在4个性状上对应的优势基因型；b. 12个SNP标记优势基因型加性效应与性状关联统计. Fig. 6 　Dominant genotypes and trait association statistics of 12 SNP markers of Micropterus salmoidesa. Correspondence of 12 SNP markers to dominant genotypes on 4 traits. b. Additive effect of dominant genotypes of twelve SNP markers with trait association statistics.
2.6　SNP标记优势基因型聚合效果分析

12个SNP标记优势基因型富集效果显示，230尾F0个体中最多富集10个优势基因型，最少富集0个优势基因型，富集3~5个优势基因型的个体最多，优势基因型富集尾数分布呈“纺锤形”(图7a)。富集优势基因型个数在富集群体上的生长性状分析结果显示(图7b)，富集优势基因型个数越多，4个性状值越高，总体均呈上升趋势。富集10个优势基因型个体4个性状值均最高，较只有1个优势基因型个体在4个性状上分别提升了74.5%、20%、20.22%和24.2%。从富集6个优势基因型开始，富集效果开始大幅提升，优势基因型聚合效果显著，但个体比例逐渐减少。

图7 　大口黑鲈优势基因型分布比较a. 优势基因型富集尾数；b. 4个生长性状富集优势基因型统计. Fig. 7 　Comparison of distribution of dominant genotypes of Micropterus salmoides. Dominant genotype enrichment numbers; b. Statistics of enriched dominant genotypes for four growth traits.

富集不同优势基因型个数与4个性状相关性结果显示(图8)；在体重上，个体富集6、7、10个优势基因型均与富集0~5个优势基因型的个体显著差异(P<0.05)；在体长和体高上，富集6个以上基因型个体中，富集7个优势基因型个体均与富集6个以下优势基因型个体显著差异(P<0.05)；在体厚上，富集6个以下优势基因型个体同样均与富集7个优势基因型个体显著差异(P<0.05)。在4个性状上，个体富集8个优势基因型均与只有1个优势基因型个体显著差异(P<0.05)，富集6个以上优势基因型个体与富集5个以下优势基因型个体的差异显著关联图大都呈对角线分布，这与SNP标记优势基因型聚合效果分析结果一致。

图8 　大口黑鲈富集优势基因型个数与生长性状相关性a. 体重；b. 体长；c. 体高；d. 体厚. 相同性状富集不同优势基因型个数组间存在显著差异(P<0.05)，以不同颜色表示. Fig. 8 　Correlation between the number of enriched dominant genotypes and growth traits of Micropterus salmoidea. Body weight; b. Body length; c. Body height; d. Body thickness. Significant differences (P<0.05) between groups enriched for different dominant genotypes for the same trait are indicated by different colors.
2.7　生长候选基因预测

对12个快长SNP标记进行候选基因预测(表5)。ANNOVAR注释结果有8个SNP标记位于内含子区，其中标记SNP24406191、SNP23355498和SNP9244620分别注释到功能候选基因diaph2、kiaa1549lb和ppip5k1b上，标记SNP19140160位于非翻译区，注释到基因fam174b上，SNP4710104位于基因si:ch211-146m13.3下游，编码亲连接素-3；标记SNP17586389位于基因LOC119902146外显子区，而标记SNP38891697位于基因LOC119913443基因间区，编码低亲和力免疫球蛋白γ Fc II-样，没有注释到具体的功能基因上。标记SNP9639603和SNP9639605紧密关联，同样位于基因zgc:66433的内含子区。

表5 　大口黑鲈生长候选基因预测 Tab. 5 　The detail information of growth candidate genes of Micropterus salmoides
3　讨论

RAD-seq技术因其不受参考基因组有无的限制，可筛选到足够数量的分子标记，实验成本低，实验周期短，在水产动物遗传图谱构建、遗传多样性分析、物种分化等领域应用广泛[27-29]。此前有关大口黑鲈生长相关SNP标记的开发主要通过转录组测序获得[30]，而通过RAD-seq技术筛选大口黑鲈快长标记尚无应用。简化基因组测序通过在全基因组范围筛选SNP位点，覆盖度更高，本研究中，快长群体共检测到2080471个SNP位点，所获SNP数量较采用转录组测序获得大口黑鲈快长SNP数量更多，更有助于快长SNP标记的挖掘。SNP是由生物体DNA序列中单个核苷酸点突变产生的多态性，这种突变可能是由单核苷酸位点的转换与颠换所导致的，转换发生在A与G或C与T之间，颠换发生在A与C、A与T、C与G和T与G之间，理论上转换与颠换发生的概率一致，而往往转换发生的概率更高。而不同物种间转换与颠换发生的概率也有差异。本研究中发现，大口黑鲈的转换与颠换的比为1.27，低于中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的1.4和鲍(Haliotis)的2.33，高于马氏珠母贝(Pinctada fucata)的0.5，转换发生的概率远远高于颠换，这可能与物种在进化过程中承受的选择压力有关[31-33]。

杂合度是衡量基因多态性的重要指标，本研究所筛选的12个与生长性状显著关联的SNP标记在群体中的平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.35和0.37，总体差异不大，观测杂合度低于期望杂合度表明存在杂合子缺失现象。在“优鲈1号”群体中检测到与生长相关SNP标记，部分SNP标记的平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.47和0.46[30]，高于本实验结果。这可能与转录组测序检测SNP标记数相对有限，经常表现出高杂合度有关。前期研究中，课题组采用微卫星标记和线粒体D-loop序列分析了美国大口黑鲈北方亚种F0与大口黑鲈“优鲈1号”、“优鲈3号”和台湾鲈等国内养殖群体的遗传多样性，发现与国内种群相比，原种F0遗传多样性水平更高且遗传结构相对独立[34]。因此认为，大口黑鲈选育驯化后进化距离的改变可能导致杂合度变化。PIC值为遗传纯合度的倒数，它是研究群体遗传多样性的重要参数。在本研究中，12个SNP 标记的平均PIC值为0.29，其中标记SNP24406191、SNP9519393和SNP17586389 PIC值<0.25，为低多态性位点，其余9个位点均为中度多态性位点(0.25<PIC<0.5)[35]。此前课题组用于遗传多样性分析的SSR标记的PIC值为0.514，在大口黑鲈“优鲈1号” EST-SNP标记中的PIC值为0.356[30]，均高于本研究中12个SNP标记的PIC值，这可能和遗传标记种类不同有关。本实验中F0群体主要来自2020年引种的3000尾原种扩繁后代，在后续大口黑鲈育种群体构建时，为保持较高的遗传多样性，应选择富集PIC值更高的SNP标记的亲本，减少富集低多态性位点的亲本。

体重、体长、体高、体厚等生长性状是影响大口黑鲈体型和产量的重要经济性状[36]，本研究发现4个生长性状均呈连续性分布，属于数量性状遗传，但SNP标记解释的表型变异最高，为6.32%，没有超过10%，缺少主效QTL[37]。本研究采用基因组测序所获得的SNP分布在23条基因组序列上，其中12个SNP标记主要分布在7条基因组序列上，分布较为集中，其中序列NW_024044237.1上分布的SNP位点最多，有3个。在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[38]、橙点石斑鱼[22]中生长SNP标记分布更为分散，这可能与不同物种的不同基因组有关。同时，与4个生长性状显著关联的SNP至少都有4个，最多有10个，表明性状会受多基因(位点)控制。同一标记也会与多性状关联，例如标记SNP38891697和SNP19140160均与体重、体长、体高和体厚关联，在草鱼[5]、鳜(Siniperca chuatsi)[39]、斑点鲈(Lateolabrax maculatus)[40]中都出现这一现象，说明在水生动物中也存在同一基因(位点)控制多性状的情况。其中标记SNP9639605与SNP9639603紧密相连，除优势基因型不同，其余在体长中的加性效应均相同，这可能是由同一基因共同控制所导致的。鱼类生长发育是极其复杂的过程，通过基因层面选择对生长性状贡献率更高的基因(位点)，更有利于生长性状的改良。本研究中发现同一SNP位点可与多性状关联，同一性状也可与多SNP位点关联，通过分析不同基因(位点)与性状之间的关联性，可为大口黑鲈快长新种质创制提供参考。

本研究中挖掘到的12个SNP标记，有8个位于内含子区，在基因间区、非翻译区等均有SNP标记，只有4个标记定位到了生长相关的候选基因，说明对生长性状的影响会通过基因表达与基因产物共同作用。所定位到的生长基因分别为fam174b、kiaa1549lb、diaph2和ppip5k1b。其中标记SNP19140160处于fam174b非翻译区，SNP可能通过基因3ʹUTR参与亚细胞定位以及蛋白的翻译过程[41]。同时，靶基因3ʹUTR的SNP位点可能影响miRNA靶向结合作用。kiaa1459lb是KIAA基因家族的一员，KIAA基因家族在人类基因组中涉及编码大型蛋白质，与生物体内细胞新陈代谢功能相关[42]。在绵羊(Ovis aries)中位点kiaa2012 g. 203440537 A>G与体长性状显著相关，可作为分子育种辅助标记[43]。diaph2作为一种蛋白质编码基因，在卵巢的发育过程中发挥作用，该基因的缺陷可能导致卵巢早衰[44]。在青鳉(Oryzias melastigma)中，通过缺氧诱导触发了miRNA失调，其中diaph2基因参与调控生殖过程进而导致了雌性生殖障碍造成个体差异，推测diaph2基因可能通过调节性腺发育过程，参与生长相关功能的调控[45]。ppip5k1b也是一种蛋白质编码基因，该基因通过编码双功能肌醇激酶，调节多种细胞过程，包括细胞凋亡、胰岛素信号传导和中性粒细胞活化等[46]。这些生长候选基因的发现为后期大口黑鲈的基因工程育种提供了科学依据。

分子标记辅助育种通过富集具有更多快长标记优势基因型的个体，从而实现优势生长性状的稳定遗传。在本研究的230尾亲本中，富集6个以上优势基因型个体只有66尾，占比仅为28.7%，但是却能在体重上提高32.07%，在体长、体高和体厚上提高10%左右，使生长性状大幅提高。同样，在建鲤(Cyprinus carpio var. jian)中富集所有优势基因型个体较未富集个体增重约14%[47]。在黄河鲤(Cyprinus carpio)中，富集了2个以上优势基因型的亲本生长性能显著提升[48]。在草鱼中，富集7个优势基因型个体在体重上提高36.3%[49]。在大口黑鲈后续F1选育过程中，在关注标记贡献率更好的同时应选择富集更多优势基因型的亲本，将更有利于遗传性状的改良。

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