仿刺参(Apostichopus japonicus)又名刺参，是棘皮动物门中经济价值较高的种类之一，具有极高的营养价值和药用价值^[1]。近年来，山东、辽宁、河北及福建等地的刺参养殖业发展迅速。随着养殖模式的发展和养殖区域的扩展，刺参的养殖总产量和面积一直处于持续增长的趋势。建立了池塘养殖、底播养殖、工厂化养殖、浅海网箱养殖、浮筏吊笼养殖、多物种混养等多元化养殖模式^[2]。然而，随着刺参养殖规模和养殖密度的不断扩大，病害问题也日益凸显，严重制约了刺参养殖业的健康发展。刺参疾病主要包括细菌性疾病、寄生性疾病和敌害生物。池塘养殖作为刺参养成的最主要模式之一，养殖面积占全国的40%以上。前期刺参池塘养殖病害以腐皮综合征为主^[3-6]，然而，随着池塘累年养殖和不规范养殖操作，池塘中发现的敌害生物也越来越多，已研究的敌害生物包括桡足类^[7-8]、海鞘(Ciona intestinali)^[9-10]、海绵动物^[11-12]、长颈麦秆虫(Caprella equilibra)^[13]、澳洲异尾涡虫(Heterochaerus australis)^[14]、鹰钩拟海牛(Melanochlamys sp.)^[15]、海星^[16]等，敌害生物已成为限制产业发展的重要影响因素。

2022年夏秋以来，通过对北方沿海池塘养殖刺参进行调查发现，青岛、威海、东营、唐山、凌海等多家养殖池塘的刺参在春、秋季出现活力下降、厌食和生长停滞等现象，严重时可导致养殖刺参产量下降20%~50%。经观察发现养殖池塘底泥表面有大量的凸起状黑点，黑点下方穴居一种小头虫，黑点集中的地方具明显臭味，没有刺参栖息，对海参养殖效益造成巨大损失。小头虫被认为是海洋有机污染的指示生物，也是海洋底栖生态系统中的高度机会主义物种，分布于各种各样的栖息地^[17]。小头虫在刺参养殖池塘中大量出现，提示池底存在底质恶化问题，这可能是养殖刺参减产的主要原因。但是，调查发现池塘泼洒杀虫药物后，小头虫大量消减死亡，刺参摄食活动等行为有所恢复，推测小头虫大量出现也对刺参有一定不良影响。因此，本研究以山东沿海刺参养殖池塘中的小头虫为研究对象，通过形态学观察、分子鉴定及系统发育分析，确定其种类，并分析不同地理群体的遗传多样性和遗传结构，以期丰富该物种的生物学基础资料，为刺参养殖病害防控提供理论参考。

2022年12月至2023年11月对山东、河北、辽宁等地刺参养殖区进行实地调查，内容主要包括：刺参养殖池塘的池底情况、的分布密度、穴居巢穴的形态与结构、刺参活动摄食和发病情况等。其间，从山东东营和青岛刺参养殖池塘采集含有大量小头虫的底泥，带回实验室后加入适量的海水，并进行微量充气暂养，利用40目筛网从底泥分离出实验所需的小头虫。

随机选取30条虫体，放置于培养皿中，每次取1条放置于载玻片上，用Nikon SMZ1500体视显微镜观察其外观形态并拍照，测量其体长和体宽(胸区最宽处)。

解剖镜下将虫体表面附着物清理干净后放入2.5%的戊二醛固定液中固定保存，经磷酸缓冲液漂洗后，进行无水乙醇梯度脱水、乙酸异戊酯置换、二氧化碳临界点干燥、镀金操作，使用TESCAN VEGA3扫描电子显微镜观察虫体的超微结构并拍照。

分离的虫体在Davidson's固定液中固定24 h，然后转入70%无水乙醇中保存。固定好的样品经酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色及中性树胶封片，用Pannoramic MIDI II-3DHISTECH数字切片扫描仪扫描，并用SlideViewer软件观察拍照。

用E.Z.N.A. TM Mollusc DNA KIT (Omega, GA, USA)试剂盒提取虫体基因组DNA，使用超微量分光光度计NanoDrop 1000检测浓度，并于−20 ℃保存备用。以基因组DNA为模版扩增18S rDNA和线粒体CO I基因序列，所用的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。PCR扩增总体系为50 μL，包括Green Taq Mix 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL, DNA模版2 μL, ddH₂O 21 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min, 35个循环(95 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min), 72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序，利用Contig Express软件进行序列拼接。

表1

表1 　物种鉴定及系统进化分析用PCR引物 Tab. 1 　PCR primer for species identification and phylogenetic analysis 引物名称primers 序列sequence 参考文献references 用途purpose CY18S (F) 5′-GCGAATGGCTCATTAAATCAG-3′ [18] 系统发育分析 phylogenetic analysis CY18S (R) 5′-CTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′ [18] LCO1490 (F) 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′ [19] HCO2198 (R) 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′ [19] 18S rDNA (F) 5′-CGGATGGCTCATTAGAACAG-3′ / 遗传多样性和遗传结构分析 analysis of genetic diversity and genetic structure 18S rDNA (R) 5′-GTGTGTACAAAGGGCAGG-3′ CO I (F) 5′-ATAGGAATTTGAGGTGGACTTG-3′ / CO I (R) 5′-GGCCGAAAAATCAGAATAAGTG-3′ ITS (F) 5′-CACACTGAACATCGACAGCTTG-3′ / ITS (R) 5′-GTTTCTTTTCCTCCGCTTACTG-3′

表1 　物种鉴定及系统进化分析用PCR引物 Tab. 1 　PCR primer for species identification and phylogenetic analysis

获得的CO I基因序列在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行Blast比对，从中选取相近物种的CO I基因序列，用MEGA 11.0软件进行多序列比对，以邻接法(neighbor- joining, NJ)构建系统发育树，并基于NCBI数据库中已有的同属物种CO I基因序列(表2)进行遗传进化分析，Bootstrap值设置为1000。

表2

表2 　用于遗传进化分析的相关物种序列来源及信息 Tab. 2 　Sequence information for phylogenetic analysis 物种名称specie name NCBI登录号NCBI accession number 国家country 参考文献references Capitella teleta OR660131-OR660133 China this study Capitella sp. LC120651-LC120653 Japan [20] Capitella aff. teleta LC120641-LC120650 Japan [20] Capitella teleta LC120627-LC120640 Japan [20] Capitella cf. capitata KX961418 USA [21] Capitella cf. aciculata KX961404 USA [21] Capitella teleta KX298243-KX298247、KX286328-KX286329 Korea [22] Capitella capitata GU672406-GU672407、HQ023469-HQ023474 Canada [23]

表2 　用于遗传进化分析的相关物种序列来源及信息 Tab. 2 　Sequence information for phylogenetic analysis

从东营和青岛刺参养殖池塘各取30条虫体，提取每个个体的基因组DNA, PCR扩增18S rDNA、CO I和ITS等3个基因片段，引物序列见表1, DNA提取方法和PCR扩增程序同上。获得的序列用MEGA11.0软件进行比对、计算遗传距离、统计碱基组成、变异位点数、简约信息位点数、突变位点数和颠换转换比率等。用DnaSP 5.0软件确定单倍型，计算两个地理群体的核苷酸多样性指数(nucleotide diversity, P_i)、单倍型数目(number of haplotypes, H)、单倍型多样性(Haplotype diversity, H_d)、平均核苷酸差异数(average number of nucleotide differences, K)和多态位点数(number of polymorphicsites, S)。使用Network 4.6软件构建单倍型网络关系图。利用Alrequin 3.5软件中的AMOVA方差分析法估算两个地理群体的分化系数(F-statistics, F_ST)和基因流(N_m)。

小头虫在刺参养殖池塘池底呈斑块分布，多存在于水草腐败、发黑发臭、有机质丰富的浮性淤泥或黏质粉砂土中，其在刺参养殖池塘中全年都存在，春、秋两季丰度较大(密度可达30个/dm²以上)。它们营穴居生活，摄食时一半身体在穴内，一半身体探出洞穴，通过左右摇摆取食池底表层沉积物和刺参的粉末饵料。虫体也可完全爬出巢穴采食，再钻入巢穴。巢穴口大小为1~3 mm，深度30~50 mm；巢穴洞口呈现为小黑点，由虫体蠕动将其排泄物和分泌物推出巢穴洞口而形成(图1)。巢穴周围有臭味、异味，刺参对该虫体分布丰度高的区域有明显躲避行为，导致刺参厌食、生长缓慢、严重时会出现吐肠现象，形成巢穴周围没有刺参栖息和摄食的局面。

图1

图1 　刺参养殖池塘底部小头虫及其巢穴a-b小头虫栖息的池塘底部实景图，箭头所指黑点为小头虫巢穴口，圆圈指示爬出巢穴的小头虫. Fig. 1 　Capitella teleta and its nest on the bottom of sea cucumber culture ponda-b. Actual view of the bottom of the pond inhabited by the Capitella teleta, the black dots indicated by the arrows are Capitella teleta nests, the Capitella teleta crawling out of the nests are in the circles.

对采自东营和青岛两家刺参养殖池塘的虫体进行形态结构比较分析，发现它们形态结构相同。虫体整体呈弯曲状、体色为红色(图2b)，体长 7.94~25.27 mm，体宽 0.65~0.94 mm (表3)。身体分为头部、胸部、腹部、尾部四部分。虫体细长，有时外部包裹一层囊膜(图2g)；头部呈圆锥状或钝圆形，由口前叶和围口节组成(图2c)，具吻无颚(图2a、f)；胸部分为九个胸节且每个胸节之间都有一层隔膜(图3a、b)，第一胸节到第七胸节具成束的毛状刚毛，基部稍粗，顶部较细，且每束6~19条不等(图2d、e，图3e)，虫体的第五胸节通常为最宽和最短的胸段；成熟的雄性个体在身体背部的第八、九胸节具有钩状生殖棘(图2c、d、h、i、j，图3b)，第九胸节的生殖棘比第八胸节的生殖棘更大更粗壮，且第八胸节的棘朝向向后，第九胸节的棘朝向向前，形成“钳状”结构；雄虫的第七、八胸节之间具有椭圆状的生殖管(图2a)；另外虫体的胸腔具有消化道器官(图2d)；多数个体胸节比腹节宽且向后逐渐变窄，通常胸部的刚毛比腹部的刚毛较多且较长，身体背部圆形，腹部较扁平，后腹部无鳃，腹沟从第五胸节一直延伸到腹部前端(图2f)，整个腹部有更深的侧沟(图2h)，成熟的雌性个体在腹部具成对的卵巢(图3c)；尾部末端具肛门(图2a、k、图3f)。

图2

图2 　小头虫外观结构观察a-b. 体视显微观察(a. 因透光原因虫体呈蓝色), c-k. 扫描电镜观察. pro：口前叶；per：围口节；gd：生殖管；gs：生殖棘；dt：消化道；ch：胸节；cc：毛状刚毛；sno：吻；vg：腹沟；env：囊膜；lg：侧沟；pyg：尾节；head：头部；thorax：胸部；abdomen：腹部；tail：尾部. Fig. 2 　Observation on the appearance structure of Capitella teletaa-b. Microscopic observation of stereomicroscope (a. the worm appear blue because of light transmission); c-k. Scanning electron microscope observation. pro: prostomium; per: peristomium; gd: genital dute; gs: genital spines, dt: digestive tract; ch: chaetiger; cc: capillary chaeta; sno: snout; vg: ventral groove; env: envelope; lg: lateral groove; pyg: pygidium.

表3

表3 　小头虫形态特征统计结果 Tab. 3 　Statistical results of morphological characteristics of Capitella teleta 指标 index 数量/条 number 最大值 max 最小值 min 平均值±标准差 mean±SD 变异系数/%CV 体长/mm  body length 30 25.27 7.94 13.87±4.31 31.07 体宽/mm  body width 30 0.94 0.65 0.79±0.08 18.25

表3 　小头虫形态特征统计结果 Tab. 3 　Statistical results of morphological characteristics of Capitella teleta

图3

图3 　小头虫组织结构观察a-d. 石蜡纵切显微观察，e-f. 石蜡横切显微观察. pyg：尾节；gs：生殖棘；sep：隔膜；ch：胸节；ov：卵巢；lm：纵肌；dt：消化道；cc：毛状刚毛；cm：环肌. Fig. 3 　Observation of the histological microstructure of Capitella teletaa-d. Microscopic observation of Paraffin longitudinal section, e-f. Microscopic observation of paraffin horizontal section. pyg: pygidium; gs: genital spines; sep: septum; ch: chaetiger; ov: ovaries; lm: longitudinal muscle; dt: digestive tract; cc: capillary chaeta; cm: circular muscle.

用18S rDNA引物CY18SF和CY18SR扩增获得长度为1619 bp的有效基因序列，通过Blast检索发现其归类于小头虫科(Capitellidae)。在此基础上，基于无脊椎动物通用CO I引物LCO1490F和HCO2198R扩增获得长度为701 bp的有效基因序列(编号为C)，通过Blast检索发现其与C. teleta序列同源性最高，相似性为99.11%。从NCBI数据库中选取了相近物种的CO I基因序列构建系统发育树，结果显示其与C. teleta聚为一支(图4)。结合其形态学特征及分子鉴定结果，确定刺参养殖池塘采集的小头虫为C. teleta，隶属于环节动物门(Annelida)、多毛纲(Polychaeta)、头节虫目(Scolecida)、小头虫科(Capitellidae)、小头虫属(Capitella)。

图4

图4 　基于CO I基因构建的小头虫属系统发育树每个节点代笔一个分类单元，分支旁边的数字为自展值，物种名旁边为NCBI登录号，星号代表本研究中的小头虫. Fig. 4 　Phylogenetic tree of genus Capitella constructed based on CO I geneEach node represents a taxonomic, the number next to the branch is the bootstrap value, the accession numbers of NCBI are given next to the species name, asterisks represent Capitella teleta in this study.

通过与NCBI中下载的相关小头虫属CO I序列的遗传进化分析结果显示，不同地区小头虫的遗传距离在0.003~0.327之间，其中韩国C. teleta和日本C. teleta的遗传距离最小为0.003；中国C. teleta与韩国C. teleta及日本C. teleta的遗传距离较小，分别为0.009和0.010，其次是日本C. aff. teleta，遗传距离为0.042 (表4)。遗传分化系数显示，中国C. teleta和韩国C. teleta之间的基因频率差异较小，日本C. teleta次之(表4)。上述结果表明中国C. teleta和韩国C. teleta、日本C. teleta亲缘关系较近，这进一步确证了刺参养殖池塘中的小头虫为C. teleta。

表4

表4 　基于CO I基因不同地区小头虫的遗传距离(对角线下方)和遗传分化系数(对角线上方) Tab. 4 　Mean genetic distance (below diagonal) and fixation index (above diagonal) based on CO I gene in different areas with Capitella teleta 物种名称specie name 1 2 3 4 5 6 7 8 1. C. teleta (China)   0.972 0.721 0.955 0.984 0.707 0.992 0.992 2. C. capitata (Canada) 0.206   0.729 0.687 0.469 0.635 0.447 0.450 3. C. teleta (Japan) 0.010 0.209   0.916 0.980 -0.021 0.980 0.980 4. C. aff. teleta (Japan) 0.042 0.207 0.033   0.986 0.920 0.988 0.988 5. C. sp. (Japan) 0.222 0.174 0.231 0.217   0.979 0.979 0.978 6. C. teleta (Korea) 0.009 0.209 0.003 0.327 0.231   0.979 0.979 7. C. cf. capitata (USA) 0.228 0.277 0.228 0.229 0.269 0.227   1.000 8. C. cf. aciculata (USA) 0.226 0.279 0.225 0.227 0.261 0.226 0.203

表4 　基于CO I基因不同地区小头虫的遗传距离(对角线下方)和遗传分化系数(对角线上方) Tab. 4 　Mean genetic distance (below diagonal) and fixation index (above diagonal) based on CO I gene in different areas with Capitella teleta

东营(DY)和青岛(QD)两个地理群体共有的18S rDNA序列长度为1482 bp，序列碱基组成比例比较稳定，4种核苷酸A、T、C、G的平均含量依次为24.5%、22.4%、23.6%、29.5%, C+G含量为53.1%，略高于A+T含量(表5)。CO I的序列长度为638 bp，其中A的平均含量为31.6%, T的平均含量为30.5%, C的平均含量为19.3%, G的平均含量为18.6%, A+T含量为62.1%，明显高于C+G含量，表现出明显的AT碱基偏向性(表5)。ITS序列长度为302 bp, A、T、C、G的平均含量分别为20.6%、25.0%、26.3%、28.1%, C+G含量为54.3%，略高于A+T含量(表5)。

表5

表5 　东营和青岛小头虫群体18S rDNA、CO I和ITS序列的碱基组成 Tab. 5 　Base compositions of 18S rDNA, CO I and ITS sequences of Dongying and QingdaoCapitella teleta populations 群体 population 18S rDNA CO I ITS T C A G C+G T C A G C+G T C A G C+G DY 22.5 23.6 24.4 29.5 53.1 40.3 18.2 21.9 19.6 37.8 24.9 26.4 20.7 28.0 54.3 QD 22.4 23.7 24.5 29.4 53.1 20.6 20.4 41.4 17.5 37.9 25.1 26.2 20.5 28.2 54.4 平均值 average 22.4 23.6 24.5 29.5 53.1 30.5 19.3 31.6 18.6 37.9 25.0 26.3 20.6 28.1 54.3

表5 　东营和青岛小头虫群体18S rDNA、CO I和ITS序列的碱基组成 Tab. 5 　Base compositions of 18S rDNA, CO I and ITS sequences of Dongying and QingdaoCapitella teleta populations

在18S rDNA基因的1482个位点中，保守位点有1446个，约占全序列的97.6%；简约信息位点有8个，约占0.5%；单突变位点有24个，约占1.6%；变异位点有35个，约占2.3% (图5)，总体转换/颠换偏倚率(R值)为0.6。CO I基因的638个位点中，保守位点约占整个序列的40.0%；简约信息位点约占56.4%；单突变位点约占3.1%；变异位点380个，约占总位点数的59.6%, R值为0.8。ITS序列的302个位点中，保守位点144个，简约信息位点157个，单突变位点1个，变异位点158个，约占总位点数的52.3%, R值为0.8。

图5

图5 　东营和青岛小头虫群体基于CO I基因的单倍型网络图圆的大小表示单倍型出现的频率，扇形面积表示该单倍型中某群体所占比例. Fig. 5 　The haplotype network based on CO I gene of Dongying and Qingdao Capitella teleta populationsThe size of the circle indicates the frequency of occurrence of the haplotype, the area of the sector indicates the proportion of a group in this haplotype.

DY、QD两个群体间的核苷酸遗传多样性参数见表6。基于18S rDNA基因序列共检测到3个单倍型(H)和29个多态位点(S)，单倍型多样性(H_d)为0.066，核苷酸多样性指数(P_i)为0.0008，平均核苷酸差异数(K)为1.193，其中DY群体H、H_d、P_i、K、S数值均高于QD群体。基于CO I基因序列共检测到28个单倍型和342个多态位点，单倍型多样性为0.949，核苷酸多样性指数为0.2957，平均核苷酸差异数为165.885, DY群体除S数值略低于QD群体外，其余均高于QD群体。基于ITS基因序列共检测到7个单倍型和155个多态位点，单倍型多样性为0.644，核苷酸多样性指数为0.0383，平均核苷酸差异数为10.806, DY群体H、H_d、P_i、K、S数值均高于QD群体。通过对比3个基因序列的遗传多样性参数，两个群体CO I基因的H、H_d、P_i、K、S数值均明显高于18S rDNA和ITS。

表6

表6 　东营和青岛小头虫群体遗传多样性参数 Tab. 6 　Genetic diversity parameter of Dongying and QingdaoCapitella teleta populations % 基因 gene 群体 population 样本数量 sample number 单倍型数目 H 单倍型多样性 Hd 核苷酸多样性指数 Pi 平均核苷酸差异数 K 多态位点数 S 18S rDNA DY 30 3 0.131 0.0017 2.434 29   QD 30 1 0.000 0.0000 0.000 0   overall 60 3 0.066 0.0008 1.193 29 CO I DY 30 20 0.956 0.1121 62.874 339   QD 30 16 0.938 0.0442 26.044 345   overall 60 28 0.949 0.2957 165.885 342 ITS DY 30 6 0.545 0.0726 20.775 158   QD 30 5 0.446 0.0020 0.593 4   overall 60 7 0.644 0.0383 10.806 155

表6 　东营和青岛小头虫群体遗传多样性参数 Tab. 6 　Genetic diversity parameter of Dongying and QingdaoCapitella teleta populations %

AMOVA分析结果如表7所示，基于18S rDNA基因群体间变异为整体变异的1.25%，遗传分化系数(F_ST)为0.012，基因流(N_m)为39.654；基于CO I基因群体间遗传变异占84.66%，遗传分化系数为0.847，基因流为0.091；基于ITS基因群体间变异为整体变异的5.58%，遗传分化系数为0.056，基因流为8.456。

表7

表7 　东营和青岛小头虫群体分子方差分析 Tab. 7 　AMOVA of Dongying and QingdaoCapitella teleta populations 基因gene 变异来源source of variation 自由度 df 平方和 sum of squares 变异组分 variance components 变异百分比/%percentage of variation 遗传分化系数fixation Index 基因流 Nm 18S rDNA 群体间 among population 1 0.817 0.00747 1.25 0.012* 39.654   群体内 within population 58 34.367 0.59253 98.75   总数 total 59 35.183 0.60000 CO I 群体间 among population 1 3629.733 120.26475 84.66 0.847* 0.091   群体内 within population 58 1263.867 21.79080 15.34   总数 total 59 4893.600 142.05556 ITS 群体间 among population 1 14.55 0.31015 5.58 0.056* 8.456   群体内 within population 58 304.233 5.24540 94.42   总数 total 59 318.783 5.55556       注：*代表P<0.05. Note: * stands for P<0.05.

表7 　东营和青岛小头虫群体分子方差分析 Tab. 7 　AMOVA of Dongying and QingdaoCapitella teleta populations

基于CO I基因序列DY、QD两个地理群体共获得28个单倍型，记录为H_1~H_28，构成以H_3为中心向外辐射的单倍型网络图(图5)。其中，H_1、H_2、H_5、H_6、H_8、H_9、H_10、H_17、H_19、H_20、H_22、H_26、H_27和H_28作为网络图外部端点而独立存在，其余单倍型则以外部辐射的网络节点而存在。不同地理群体的单倍型分布较为集中，28个单倍型中存在3个共享单倍型(H_3、H_13和H_18)，占总单倍型的10.7%，其余25个单倍型为DY或QD群体所特有。

形态学鉴定是物种鉴定的基本方法，但仅靠形态特征难以准确鉴定小头虫的种类。CO I基因作为动物线粒体基因组(mtDNA)中的蛋白编码基因之一，进化速度快，其高度变异性和在物种内的保守性使其成为一种理想的DNA标记^[24]。本研究在形态学观察的基础上，对小头虫的线粒体CO I基因进行了特异性扩增，鉴定刺参养殖池塘中的小头虫为C. teleta。该虫与韩国C. teleta和日本C. teleta的遗传距离和遗传分化系数较小，具有较近的亲缘关系，其形态特征与Jeong等^[22]描述的韩国海域C. teleta和Li等^[25]描述的山东海域C. teleta的特征一致，与日本和美国小头虫有所差异，其每束刚毛的数量多于日本^[20]和美国^[21]。本研究的C. teleta与巴西海岸的4种小头虫新物种(C. aracaensis sp. n.、C. biota sp. n.、C. neoaciculata sp. n.、C. nonatoi sp. n.)的头部形态差异较明显^[26]，如C. biota sp.n.的口前叶较本研究中C. teleta的口前叶略尖；C. neoaciculata sp. n.和C. nonatoi sp. n.的口前叶背侧相较于C. teleta有明显凹陷。

亲缘关系越近的分类阶元之间，核苷酸替换以转换为主要形式；反之，则更倾向于发生颠换^[27-28]。本研究中，基于18S rDNA、CO I和ITS 3个基因，小头虫序列总体偏倚率R值均小于1，即核苷酸替换以颠换为主，说明东营和青岛小头虫群体之间的亲缘关系较为疏远。根据Grant等^[29]学者的研究，将H_d值设定为0.5, P_i值设定为0.005作为临界标准，数值越大表示生物群体的遗传多样性越高。本研究结果显示，3个基因片段中，18S rDNA序列表现最为保守，遗传多样性较低(H_d<0.5, P_i<0.005)，而CO I和ITS序列表现出较高的遗传多样性(H_d>0.5, P_i>0.005)。此外，东营群体的遗传多样性水平高于青岛群体，可能是由于黄河口流水冲击产生大面积滩涂的变迁，致使小头虫种群长距离迁徙，产生了较为活跃的基因交流，从而提升了遗传多样性水平。

F _ST取值范围为0~0.05，表示群体间遗传分化很小；0.05~0.15表示中等程度的遗传分化；0.15~0.25表示遗传分化较大；超过0.25则意味群体间有很大的遗传分化^[30]。基因流(N_m)表明基因在群体间的交换程度，N_m越大说明群体间的基因交流频率越高^[31-33]。N_m小于1时，意味群体间基因交流受限；N_m大于4时，各群体处于随机交配状态，基因流成为影响群体遗传分化的主要因素^[34-35]。本研究中，基于18S rDNA序列东营和青岛两个小头虫群体遗传分化很小，基因流较大；基于CO I序列两群体产生很大程度的遗传分化，基因交流频率较弱；基于ITS序列群体间存在中等程度的遗传分化，基因交流较频繁。遗传变异结果显示，基于18S rDNA和ITS基因序列遗传变异来源于群体内，而基于CO I基因序列遗传变异主要来自于群体间，表明线粒体CO I基因群体内结构相对保守，群体间差异较大，可作为小头虫种类鉴定和种群遗传结构分析的理想分子标记^[36]。单倍型网络图可以反映出各单倍型在各个地理群体中的分布情况及单倍型之间的演化关系。本研究中，两个群体共享的CO I基因单倍型仅占10.7%，每个地理群体的单倍型分布较为集中，形成明显的系统地理结构。综上，东营和青岛小头虫群体间存在一定程度的遗传分化，且东营群体的遗传多样性较高，两个群体的亲缘关系较为疏远，这有助于我们预测小头虫对药物抗性的发展，对后续开展药物防控工作具有一定的指导意义。

本研究以形态学特征和分子生物学分析结果为依据，确定山东刺参养殖池塘中出现的小头虫为C. teleta，通过对东营和青岛小头虫群体的遗传关系解析发现，东营群体的遗传多样性较高，两个群体的亲缘关系较疏远，相关结果为该物种防控提供了科学数据。今后将继续对该物种进行深入研究，查清小头虫进入养殖系统的途径，解析小头虫在水产养殖系统内的繁殖过程与特征，探究小头虫的分泌物和排泄物对刺参是否有毒害作用，为保障刺参高效养殖提供理论依据和技术支撑。