海马（Hippocampus spp.）是一种小型的海洋鱼类，属于海龙科小型硬骨鱼，因特殊的体型而得名。膨腹海马（Hippocampus abdominalis）又称大肚海马，为辐鳍亚纲（Actinopterygii），海龙目（Syngnathiformes），海龙科（Syngnathidae），海马属（Hippocampus），是所有已知海马种类中最大的一种。膨腹海马主要分布在西南太平洋区的澳大利亚及新西兰，栖息在浅海珊瑚礁和藻类丰富的海域^[1]，主要以小型浮游生物为食^[2]。

海马是中国水产经济中重要的高价值海水鱼类，作为一种传统药材，具有极高的药用价值，一度被誉为“南方人参”^[3]，以海马为原料所开发的药品已达数十种，可见我国原材料海马的市场需求量较大^[4]。此外，海马也是我国二级保护动物，近年来，海马逐渐成为水族爱好者的观赏品种，逐渐频繁地走进大众视野^[5]。海马因其较高的营养、药用和观赏性价值获得了人们的广泛认可，并且市场需求旺盛，人工养殖前景广阔。

近年来，随着海洋生态环境的变化、近海污染的加剧和人类活动的增加，膨腹海马的数量和分布受到了严重的影响，野生物种已经濒危。为保护海马资源、满足市场需求，海马的人工养殖繁育已经成为了唯一的选择^[6]。随着自然环境的恶化和人工繁育代数的增加，海马的遗传多样性可能出现了退化。物种遗传多样性是生物多样性的关键组成部分，它涉及到地球上数百万种不同物种的生存和繁衍。但随着时间的变化，物种的遗传多样性会因为近亲繁殖和遗传漂变而降低，从而导致该物种丧失环境适应能力和抗病力降低，所以物种拥有高水平的遗传多样性具有非常重要的意义^[7]。因此，探索和保护膨腹海马物种遗传多样性具有重要意义。

SSR（simple sequence repeats，简单序列重复）标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA（microsatellite DNA），为1~6个碱基串联重复序列^[8]，微卫星标记广泛分布于基因组中，并且不受环境影响，具有中性、共显性、高度的多态性和跨基因组的随机分布等特性，广泛应用于水产动物的遗传结构分析、种质评价及亲子鉴定等研究^[9-11]。为了解不同地区膨腹海马养殖群体的遗传多样性，本研究基于本实验室先前转录组结果，选取了6个微卫星位点进行鉴定，并对不同地区（中国山东、中国福建、中国台湾以及澳大利亚）的5个膨腹海马养殖群体进行遗传多样性分析，以期为膨腹海马养殖群体的遗传资源保护和种质开发提供理论依据。

实验所用的膨腹海马群体为中国山东繁育第三代群体（SD）、福建繁育第一代群体（FJ1）、福建繁育第六代群体（FJ6）、台湾繁育第十二代群体（TW）以及澳大利亚野生群体繁育的子代（AS），其中SD、FJ和TW都是引进自AS群体的不同子代，5个群体的地理位置如图1a所示。对5个群体的膨腹海马分别取其背部肌肉适量，其中SD、FJ1、FJ6、TW养殖群体各取30个样品，AS养殖群体取数24个样品，共144个肌肉样品，于−80 ℃保存备用

图1

图1 　5个膨腹海马种群的地理位置及UPGMA聚类结果a. 样品采集位置信息，SD：山东第三代群体；FJ1：福建第一代群体；FJ6：福建第六代群体；TW：台湾第十二代群体；AS：澳大利亚野生群体繁育的子代. b. 群体聚类结构分析. Fig. 1 　The sampling locations and UPGMA clustering results of 5 Hippocampus abdominalis populationsa. Sampling locations. SD: the third cultured stock in Shangdong Province; FJ1: the first cultured stock in Fujian Province.; FJ6: the sixth cultured stock in Fujian Province; TW: the twelfth cultured stock in Taiwan Province; AS: the offspring of wild population breeding in Australia. b. UPGMA clustering results of 5 populations.

采用基因组DNA提取试剂盒（北京金沙生物技术有限公司）提取每个样品的DNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，微量分光光度计测其浓度，−20 ℃保存备用。

根据本实验室前期开展的膨腹海马转录组测序得到SSR序列，使用Primer6.0软件设计引物并进行PCR扩增，所有F引物的5ʹ端合成荧光修饰引物，选用FAM、HEX、TAMRA、ROX 4种荧光修饰；R引物合成PAGE引物，由北京擎科生物科技有限公司合成。用最后扩增良好的荧光PCR产物进行3730xl测序仪检测用软件Gene mapper 4.1对检测数据进行分析，根据分析结果，判断不同引物是否具体片段多态性，最后获得6对符合条件的引物（表1）。

表1

表1 　筛选出的引物信息 Tab. 1 　Selected primer information 引物名 primer 引物序列(5ʹ−3ʹ) primer sequence (5ʹ−3ʹ) 产物长度/bp product length HM1 F: TGTGTTCGGTCAAGCCTTTC 201   R: GGACAAGCAAGACTTCTAAG HM2 F: TAGTTGAGGACCACTGGAGT 185   R: CAGTGAAACTCCTCTACAACG HM4 F: TGTTAAGACCGAATGGCTGT 276   R: CCAGTGTCTCTGCTTGCTCT HM6 F: GCTAAGTCACTGCTGAGTGT 215   R: CCTCTTTGAGGACGAAGAC HM7 F: TCTCACTGTCATTTCCTGTG 187   R: TGATGTAGTCCATGCAGACG HM8 F: TAACCTGGCTAAGTGGAGCA 230   R: GTGTCATCTATGCAAGAGGAC

表1 　筛选出的引物信息 Tab. 1 　Selected primer information

用合成的引物进行扩增，以擎科金牌Mix（green）进行PCR扩增，扩增体系为20 μL，各组分如下：金牌Mix（green）17 μL、10 μmol/L Primer F（加接头）1 μL、10 μmol/L Primer R 1 μL、Template（gDNA）1 mL。PCR扩增程序：98 ℃预变性2 min; 98 ℃ 10 s，各引物特异性退火温度（表1）10 s，72 ℃ 10 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测。用最后扩增良好的荧光PCR产物进行3730xl测序仪检测，得到的数据使用Genemapper软件进行分析。

SSR位点和群体的各项遗传多样性指标分别在Popgen32和GenAlEx 6.501版软件中，分别计算SSR位点和群体的各项遗传多样性指标，包括观测等位基因（N_a）、有效等位基因（N_e）、香农指数（I）、多态性信息指数（PIC）、观测杂合度（H_o）、期望杂合度（H_e）、主要等位基因频率（MP）和近交系数（F_is）。本研究的种群遗传结构基于贝叶斯模型的群体聚类方法，在Structure 2.3.3版软件中进行，采用马尔科夫链蒙特卡洛（Markov Chain Monte Carlo，MCMC）方法，预设群体分组（K）的同时根据等位基因频率对个体进行计算、抽样和分组。设置K值的数据范围为1~10，每个K值进行10次独立的runs，每个循环的重复抽样次数设置为100000次。最后，在STRUCTURE HARVESTER网站中，根据Evanno等^[12]的方法，计算出最适的K值。

本研究所采用的6对微卫星引物在144个样本个体中共检测出63个等位基因位点。其中，最小等位基因数目为8，最大等位基因数目为14，平均等位基因数为10.5。有效等位基因总数为33.9425。平均位点有效等位基因数为5.6571。香农指数的数值范围1.5481~2.2957，平均值为1.8678。观测杂合度（H_o）和期望杂合度（H_e）的数值范围分别为0.4861~0.8194和0.7185~0.8865，均值分别为0.6603和0.8104。近交系数平均值为0.1201，数值为−0.0443~0.2984。多态性信息指数（PIC）的数值范围为0.6847~0.8725，平均值0.7834，6对引物均具有较高的多态信息（PIC>0.25）（表2）。综上，本实验开发的6对引物的多态性较高。

表2

表2 　6对SSR引物的多态性 Tab. 2 　Polymorphism of 6 pairs of SSR primers locus位点 N a N e I PIC H o H e PHWE HM1 8 5.5725 1.8048 0.7963 0.7246 0.8235 0.0147* HM2 10 6.5465 1.9792 0.8287 0.8194 0.8502 0.0328* HM4 10 5.6533 1.9553 0.8035 0.6715 0.8261 0.0000*** HM6 10 3.5208 1.5481 0.6847 0.6389 0.7185 0.1123 ns HM7 11 4.0755 1.6236 0.7144 0.4861 0.7573 0.0000*** HM8 14 8.5739 2.2957 0.8725 0.6214 0.8865 0.0000*** mean 10.5000 5.6571 1.8678 0.7834 0.6603 0.8104 0.0266 St. Dev 1.9748 1.8095 0.2717   0.1113 0.0618   注： N a，观测等位基因，Ne，有效等位基因，I，香农指数，PIC，多态信息指数，Ho，观测杂合度，He，期望杂合度，PHWE，哈迪温伯格平衡. *, P<0.05, **, P<0.01, ***, P<0.001, ns, P>0.05. Note:Na, observed allele, Ne, effective allele, I, Shannon index, PIC, polymorphic information index, Ho, observed heterozygosity, He, expected heterozygosity, PHWE, Hardy Weinberg equilibrium. *, P<0.05, **, P<0.01, ***, P<0.001, ns, P>0.05.

表2 　6对SSR引物的多态性 Tab. 2 　Polymorphism of 6 pairs of SSR primers

对来自5个地区的144个膨腹海马个体进行基因分型，在6个微卫星位点确定了203个等位基因（表3），所有6个微卫星的等位基因数范围为5~11，平均等位基因数为6.7999。

表3

表3 　5个膨腹海马种群的引物多态性 Tab. 3 　Primer polymorphism in 5 Hippocampus abdominalis populations sample 样品 sample size 样品数量 指数 parameter 位点 locus 均值mean HM1 HM2 HM4 HM6 HM7 HM8 SD 30 A 6 6 7 6 6 8 6.5000     A t 4.7020 3.8877 4.0833 2.3684 3.5156 5.0637 3.9368     H e 0.8041 0.7554 0.7688 0.5876 0.7277 0.8183 0.7436     H o 0.8750 0.8667 0.8929 0.4333 0.7667 0.8077 0.7737     F is −0.1114 −0.1668 −0.1824 0.2500 −0.0714 −0.0065 −0.0481     P 0.0007 0.0021 0.0382 0.0007 0.0000 0.0000 0.0070 FJ1 30 A 6 7 7 5 6 10 6.8333     A t 5.2023 5.7692 5.3060 4.2056 3.0405 5.3097 4.8056     H e 0.8215 0.8407 0.8258 0.7751 0.6825 0.8254 0.7952     H o 0.8333 0.8333 0.7241 0.7333 0.2000 0.5000 0.6374     F is −0.0316 −0.0081 0.1077 0.0379 0.7020 0.3840 0.1987     P 0.5767 0.9629 0.0000 0.0652 0.0000 0.0000 0.2675 FJ6 30 A 6 7 8 5 7 9 7.0000     A t 4.8649 5.5901 4.4039 4.2056 3.2550 5.6604 4.6633     H e 0.8079 0.8350 0.7881 0.7751 0.7045 0.8373 0.7913     H o 0.8000 0.8667 0.5000 0.7667 0.4667 0.5667 0.6611     F is −0.0070 −0.0555 0.3531 −0.0058 0.3264 0.3117 0.1538     P 0.5325 0.3182 0.0461 0.1106 0.0004 0.0000 0.1680 TW 30 A 6 7 7 6 7 11 7.3333     A t 5.0562 5.0279 5.1873 4.0089 4.0449 5.7325 4.8430     H e 0.8158 0.8147 0.8209 0.7633 0.7655 0.8395 0.8033     H o 0.7333 0.7333 0.5667 0.7000 0.5333 0.7000 0.6611     F is 0.0859 0.0846 0.2980 0.0674 0.2915 0.1521 0.1633     P 0.0537 0.5989 0.0000 0.2544 0.0000 0.0000 0.1512 AS 24 A 5 6 7 6 5 9 6.3333     A t 2.3226 3.6571 3.6456 1.9794 2.6605 5.2364 3.2503     H e 0.5816 0.7420 0.7411 0.5053 0.6374 0.8262 0.6723     H o 0.3333 0.7917 0.6667 0.5417 0.4583 0.5417 0.5556     F is 0.4146 −0.0896 0.0813 −0.0947 0.2656 0.3305 0.1513     P 0.0000 0.0001 0.0018 0.9947 0.0000 0.0000 0.1661 注： A，等位基因数；At，等位基因丰富度；He，预期杂合度；Ho，观察杂合度；Fis，近亲繁殖系数；P, HWE P值；*，连续Bonferroni校正后明显偏离HWE. Note:A, number of alleles; At, allele richness; He, expected heterozygosity; Ho, observe heterozygosity; Fis, inbreeding coefficient; P, HWE P-value; *, after continuous Bonferroni correction, there is a significant deviation from HWE.

表3 　5个膨腹海马种群的引物多态性 Tab. 3 　Primer polymorphism in 5 Hippocampus abdominalis populations

为了解不同群体间遗传关系，在Popgen 32中计算了群体间的遗传距离。结果如表4所示，5个群体中FJ1和FJ6间的遗传距离最小，为0.0461; FJ1和TW间的遗传距离最大，为0.4529，遗传距离分析表明，5地理群体之间的遗传距离都明显高于2%，说明产生了群体间遗传分化。此外，笔者构建了群体的UPGMA树（图1），由图可知，5个地理群体聚类为2个进化分支，福建、山东和澳大利亚聚为一支，而台湾地区的单独聚为一支。

表4

表4 　5个膨腹海马群体间的遗传相似性(上三角)和遗传距离(下三角) Tab. 4 　Genetic identity (upper triangle) and genetic distance (lower triangle) between 5 Hippocampus abdominalis populations 群体名称 population ID SD FJ1 FJ6 TW AS SD   0.7522 0.7130 0.7057 0.7535 FJ1 0.2847   0.9550 0.6358 0.7423 FJ6 0.3382 0.0461   0.6480 0.6790 TW 0.3486 0.4529 0.4339   0.6602 AS 0.2830 0.2980 0.3871 0.4151

表4 　5个膨腹海马群体间的遗传相似性(上三角)和遗传距离(下三角) Tab. 4 　Genetic identity (upper triangle) and genetic distance (lower triangle) between 5 Hippocampus abdominalis populations

从分子方差分析（AMOVA）结果可知（如表5），种群内遗传变异较大，占变异总量的89%，种群间的遗传变异仅占11%，说明了在种群间基因流动非常快，从而变异不大，PCoA结果也表明5个群体间的遗传变异较小（图2），由此可见种群的遗传变异主要来自群体内。在STRUCTURE（2.3.3版本）软件中基于贝叶斯模型的群体聚类方法，计算得出5个群体的最适delta K值为2（图3），表明了5个种群中有2个基因库的存在。由图4可知，当K=2时，SD和TW这两个种群的基因组成主要来源于基因库2，FJ1、FJ6和AS这3这种群的基因组成主要来源于基因库1和2。

表5

表5 　5个膨腹海马种群AMOVA分析 Tab. 5 　AMOVA analysis in 5 Hippocampus abdominalis populations source df SS MS Est. Var. % among pops 4 97.829 24.457 0.664 11 within pops 139 747.983 5.381 5.381 89 total 143 845.813   6.045 100 注：source，变异来源；df，自由度；SS，平方和；Est. Var.，方差分量；%，变异百分比；among pops，群体间；within pops，群体内. Note: source, source of variation; df, degrees of freedom; SS, sum of squares; Est Var., variance component; %, variation percentage; among pops, between groups; within pops, within a group.

表5 　5个膨腹海马种群AMOVA分析 Tab. 5 　AMOVA analysis in 5 Hippocampus abdominalis populations

图2

图2 　144个膨腹海马样品的PCoA结果SD：山东第三代群体；FJ1：福建第一代群体；FJ6：福建第六代群体；TW：台湾第十二代群体；AS：澳大利亚野生群体繁育的子代. Fig. 2 　PCoA results of 144 Hippocampus abdominalis samplesSD: the third cultured stock in Shangdong Province; FJ1: the first cultured stock in Fujian Province.; FJ6: the sixth cultured stock in Fujian Province; TW: the twelfth cultured stock in Taiwan Province; AS: the offspring of wild population breeding in Australia.

图3

图3 　Structure分析的ΔK方法绘制的K值变动图 Fig. 3 　Structure analysis ΔK-value variation chart drawn by K-method

图4

图4 　K=2时144个样品的Structure结果不同颜色代表不同基因库；SD山东第三代群体；FJ1：福建第一代群体；FJ6：福建第六代群体；TW：台湾第十二代群体；AS：澳大利亚野生群体繁育的子代. Fig. 4 　Structure results of 144 samples at K=2different colors represent different gene pools; SD: the third cultured stock in Shangdong Province; FJ1: the first cultured stock in Fujian Province.; FJ6: the sixth cultured stock in Fujian Province; TW: the twelfth cultured stock in Taiwan Province; AS: the offspring of wild population breeding in Australia.

SSR广泛存在于真核生物和原核生物基因组中^[13]，已广泛应用于谱系鉴定、亲缘关系检测、遗传多样性分析、种质资源评价、遗传图谱构建及基因定位等领域^[14-15]。目前，SSR已广泛应用于哺乳动物的遗传分析中^[11]，近年来SSR也广泛应用于比较水生物种群体内和群体间的遗传多样性关系的相关研究中^[16-18]。海马具有抗血栓、抗衰老等多种药用功能，是一种经济价值较高的名贵海产中药材^[19]，近年来，我国海马养殖产业发展迅速，目前我国海马人工养殖规模已达到世界第一，养殖技术也达到了领先水平^[20]。但鱼类养殖过程中容易出现互相混杂和近交衰退等现象^[21]，影响海马养殖群体的遗传多样性，因此本研究通过微卫星标记探索我国主要养殖地区膨腹海马养殖群体间的遗传多样性，以评估现有养殖群体的遗传多样性是否丰富，为膨腹海马的种质保存和繁育提供参考。

多态信息含量能够反映出某一群体中出现多态性的程度^[22]，可以用于评估遗传标记的变异程度和遗传多样性。本研究筛选出6个多态性SSR位点，分析了5个养殖群体之间的遗传关系。开发的6对微卫星位点在144个样本个体中共检测出63个等位基因位点，等位基因数目的范围在8~14之间，在群体等位基因数目分析中发现，AS群体的平均等位基因数目最少（平均6.333个），这可能与AS群体样本在养殖环境中存在人工选择作用相关。同时在本研究中发现6个微卫星位点都具有高水平的多态性（PIC>0.25），该研究结果与唇裸重唇鱼^[10]和大口黑鲈^[23]等相关的水生动物的研究结果相近，这表明本研究筛选的6个微卫星标记可作为膨腹海马养殖群体遗传多样性及遗传结构分析的良好评价工具。

观测杂合度和期望杂合度是遗传学中用于衡量遗传变异或基因座位多样性的重要参数^[24]，可以用于评估遗传资源的多样性。在生物种群中，遗传多样性是维持物种生存和进化的基础。期望杂合度和观测杂合度越高，说明该基因座位的遗传变异越丰富，物种的遗传资源越丰富。这对于保护物种、育种研究和生物进化研究具有重要的意义。DeWoody等^[25]基于微卫星标记对13种淡水鱼类的遗传多样性进行了研究，结果显示，13种鱼类的期望杂合度平均值为0.4600，认为其遗传多样性较丰富。本研究开发的6个微卫星位点在144个样品中测出的测杂合度和期望杂合度的数值范围分别为0.4861~0.8194和0.7185~0.8865，均值分别为0.6603和0.8104，本研究中遗传多样性参数高于DeWoody等^[25]的研究结果。此外，与引进的原种群体（AS）比较4个养殖群体（SD，FJ1，FJ6和TW）在杂合度方面没有显著变化，说明了5个群体的遗传资源相对丰富。这些结果表明膨腹海马虽然人工繁殖多代但是其遗传多样性相对丰富，可继续用于人工繁育养殖。遗传距离是衡量群体间遗传分化程度的重要指标，通过F_is、AMOV、FCA和结构分析表明，膨腹海马的遗传变异大部分来自种群内，小部分来自于种群间，各个群体都保持着较高水平的遗传距离。本研究中，5个群体的遗传距离为0.0461~0.4529，其中FJ1和FJ6间的遗传距离最小，FJ1和TW间的遗传距离最大，为0.4529，这表明了5个地区的人工选育过程对膨腹海马的遗传结构产生了一定的影响，且从聚类分析和Structure结果推测福建养殖群体和台湾地区养殖群体可能开始出现了遗传分化，这种差异很可能是因为在养殖过程中，人工选择对于这些养殖群体的影响，后期繁育过程中可以采用两个地区群体进行混合繁育，以提高膨腹海马遗传多样性。

本研究共筛选鉴定了6个多态性微卫星位点，6对微卫星引物在144个样本个体中共检测出63个等位基因点。所有6个微卫星的等位基因数范围为8~14之间，平均为10.5。观察到的杂合度和预期杂合度平均值分别为0.4861和0.8194。遗传距离是衡量群体间遗传分化程度的重要指标，5个群体中FJ1和FJ6间的遗传距离最小，为0.0461; FJ1和TW间的遗传距离最大，为0.4529，各个群体都保持着较高水平的遗传距离。这些结果都表明这5个膨腹海马群体遗传多样性总体较丰富，但是群体之间存在差异，这些结果为膨腹海马群体遗传多样性评价及人工繁育种群选择等提供了理论支持。