生物矿物化学经常被用于鱼类产卵场的鉴别和生活史事件的推断等^[1]，而生物矿物质主要由钙基衍生物组成，如耳石中的碳酸钙和鳞片、鳍条、骨骼中的磷酸钙等^[1]，因此，准确来说，是硬组织微化学为不同种群地理分布的区分和推断单个鱼类的环境历史提供了强大工具^[2]。近些年来，随着大型水利设施的修建、过度捕捞、生境破坏等，野外水体的自然资源量不断锐减，为了满足人民群众对鱼类等水产品资源的食用需求、对休闲渔业资源的娱乐需求，各级政府开始实施一系列的保护政策，其中最主要的政策是利用人工繁殖的苗种来进行增殖放流，即向天然水体中投放人工孵化的鱼、虾、蟹、贝类等来增加野外水产品的数量^[3]。然而，为了对人工孵化的种群和野外群体进行有效区分，对种群增强型渔业效果进行持续监测，需要一种可靠和持久的方法来标记放养鱼类。而在标记放流中，较小的个体的存活率会对渔业资源的动态变化产生重大影响，因此许多标记技术已被开发并应用于小型鱼类，以便确定此类计划是否成功^[4]。

目前能够应用于小型鱼类鉴定的标记方法多种多样，主要可区分为体外标记、体内标记和分子标记等。在增殖放流中，近年来，使用元素来标记或鉴定鱼类的来源受到了相当大的关注^[5-8]。锶(Sr)可能是耳石研究中最常用的微量元素，因为它常被证明与水中的盐度呈正相关^[9-10]，耳石中的Sr/Ca比值测定已经在欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)^[11]、奇努克鲑(Oncorhynchus tshawytscha)^[12]、刀鲚(Coilia nasus)^[13]、毛鳞鱼(Mallotus villosus)^[14]、灰鲻(Mugil cephalus)^[15]、蓝点马鲛(Scomberomorus niphonius)^[16]等多种鱼类上得到了成功应用。

在耳石研究中，耳石第一日轮的发现对鱼类资源量的评估以及研究都起到一定的基础作用。1899年Reibisch在欧洲鲽(Pleuronectes platessa)上首次观察到了年轮^[17], 1971年，Panella^[18]在银无须鳕(Merluccius bilinearis)上发现耳石的每日生长增量，这些研究推动了对鱼类耳石微观结构进行解释成为鱼类生物学研究的热点^[19]。所谓日轮就是指在鱼类耳石上，由窄的间隙带和宽的生长带所构成的生长轮，其沉积率是1轮/d，直到现在耳石微观结构等基础内容仍是研究的重点。耳石存在于大多数硬骨鱼类的内耳的膜迷路内，有矢耳石、微耳石、星耳石3种类型^[19]，大多数研究在以耳石为研究对象时，都采取3类耳石中较大的一个^[20-21]，较少同时以3类耳石进行分析探讨。相关研究曾通过标记确定了耳石第一日轮的形成时间^[22-24]，大多也都是对同一种类型的耳石作为研究对象。一般认为，鱼体耳石在鱼体开始孵化时便开始形成，但也有部分文献描述称鱼体3类耳石形成时间不一致，对于草鱼仔鱼3类耳石，仍缺乏直接的证据阐明其3类耳石形成的具体时间。

草鱼是我国主要的经济鱼类，作为大宗淡水鱼之一，在水产养殖的实践中，对草鱼个体放流后资源量的恢复如何进行有效评估等仍处于瓶颈阶段。同时，考虑到目前国内外标记方法存在的影响标记鱼正常生活、死亡率高、人力物力花费多或标记易丢(消失)等“瓶颈”问题，锶元素是否能够在草鱼仔鱼耳石上形成有效标记，成功区分人工增殖放流种群和野外自然资源种群等问题仍需解决。在之前的研究中，常剑波等^[25]曾报道草鱼仔鱼的微耳石在出膜后第2天沉积第1个生长轮，除此之外，并未有研究对草鱼的3类耳石确切形成时间进行验证，草鱼个体3类耳石的日轮形成特征等规律也仍需探索。因此本研究以浓度80 mg/L的六水氯化锶溶液对约9日龄的草鱼仔鱼进行2 d浸泡，通过电子探针微区分析仪对其浸泡后养殖阶段3类耳石的微量元素含量进行比较分析，探究六水氯化锶对草鱼仔鱼标记的可行性，并结合3类耳石的锶标记环和日轮形成规律分析探索3类耳石的第一日轮形成时间及标记时滞特征。

本实验在江苏省无锡市中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南区实验基地开展。实验所用草鱼仔鱼(图1)由上述基地采购(3日龄)。鱼苗采购之后放在装有经48 h曝气后自来水的玻璃缸(长×宽×高=100 cm×45 cm×50 cm)中暂养。暂养过程中投喂蛋黄水，每日投喂两次，每日清理鱼体排泄物及换水一次，换水量占养殖水体的1/4。在暂养期间养殖水体均正常充气增氧，水温在23~32 ℃之间，自然光照，不控光周期。

图1

图1 　本实验中所用鱼体样本照及3类耳石以浸泡完成后恢复饲养第5天样本为例. Fig. 1 　Photograph of the fish and the three types of otoliths used in this experimentBased on the 5th day of post-immersion culture.

实验可分为两个阶段，第一个阶段为浸泡标记阶段。使用80 mg/L的六水氯化锶对草仔鱼进行2 d浸泡，实验浓度参考邱晨等^[26]对鲤的六水氯化锶浸泡标记浓度，同时设置对照组0 mg/L。实验时随机选取规格基本一致[平均全长为(8.94± 0.96) mm，平均体重(0.005±0.001) g]的草鱼仔鱼，对照组和实验组(分别设置5个重复)均置于实验专用标记玻璃缸(长30 cm×宽20 cm×高30 cm) 中。浸泡标记期间不喂食，同时统计12、24 h对照组及标记组的个体急性死亡情况。第二个阶段为恢复饲养阶段。浸泡标记结束后，将标记组和对照组实验鱼移出放至恢复饲养缸(长×宽×高=50 cm× 50 cm×40 cm)中继续养殖。在恢复饲养期间前期继续投喂蛋黄水，待草鱼达到30日龄后开始投喂粉状普通配合饲料，每日投喂两次，每日清理鱼体排泄物及换水一次，换水量占养殖水体的1/3。本研究中样本采集分为两个阶段，在恢复饲养第0~40天的过程中，标记组和对照组每隔5 d定期取样，每次取样5尾。取至第40 d后，每隔10 d取样1次，同样是每次取样5尾，直至取样到第60天结束。取样之后利用电子天平测量其体重，电子游标卡尺测量其全长(数据分别精确至0.001 g和0.01 mm)。第0~20天的样品保存在100%无水乙醇中，放至4 ℃冰箱中冷藏，25~60 d的样品直接放入自封袋中，于−20 ℃下冷冻。在恢复饲养期间统计标记组和对照组死亡数，并及时移出死鱼。

在解剖镜(NV10, Shanghai Precision Instruments Co., Ltd., Shanghai, China; Figure 1)下迅速取出鱼头部球状囊中的矢耳石(sagitta)、瓶状囊中的星耳石(asteriscus)、椭圆囊中的微耳石(lapillus)，在恢复饲养第0天的样品中，仅对矢耳石和微耳石进行了分析。所有耳石样本首先用Elga Purelab Water System (CLXXXDIM2, ELGA, High Wycombe, UK)超纯水冲洗，99.7%无水乙醇干燥。然后所有样本用环氧树脂(Epofix, Struers，丹麦)进行包埋处理，经2000目和4000目砂纸打磨至核心即将暴露，再用自动化磨抛机(LaboPol-35, Struers, Denmark)配合抛光液(OP-S NonDry, Struers, Rødovre, Denmark)将其抛光至核心完全暴露且耳石表面无明显划痕。最后，将样品放入超声波清洗机中清洗，再用Milli-Q水冲洗，完全干燥后，用真空镀膜机(JEE-420，日本电子株式会社，日本东京)镀膜(36 A, 25 s)。利用X射线电子探针微区分析仪(EPMA, JXA-8100，日本电子株式会社，日本东京)对耳石进行元素线分析和面分布检测。线分析检测即测量了每个耳石样本的中轴线从核心到边缘的最长轴线上的Sr和Ca浓度，加速电压和光束电流分别为15 kV和2×10⁻⁸ A。由于耳石样本较小，其中分析设定参数做了部分调整，电子束聚焦在直径为2 μm的点上，测量间隔为4 μm。面分布检测的加速电压为15 kV，光束电流5×10⁻⁷ A，计数时间30 mS，像素尺寸6×6 μm，电子束聚焦在直径为5 μm的点上。使用从中国地质科学院购买的碳酸钙(CaCO₃)和钛酸锶(SrTiO₃)标准品验证测量质量。耳石样本照及日轮背散射电子图像(BSE)通过飞纳台式扫描电子显微镜(Pure-SED, Thermo Fisher Scientific, Eindhoven, The Netherlands)拍摄，加速电压为5 kV。

本研究中线分布数据采用Excel 2016软件进行分析、作图。采用SPSS 26.0 (Mann-Whitney U test)对相同恢复养殖时间下标记组与对照组的平均体重和平均全长进行差异显著性分析，设定差异显著性水平P为0.05，当P<0.05时为差异显著，当P>0.05时为差异不显著。由于耳石中的Sr含量远小于Ca含量，所以按惯例Sr/Ca值指经过标准化的比值，即统一用(Sr/Ca)×1000的比值表示(简称Sr/Ca比值)，不同区域Sr/Ca比值用$\bar x \pm \user2{SD}$表示。

使用六水氯化锶对草鱼仔鱼进行2 d浸泡标记，恢复饲养60 d，标记组和对照组在两个阶段均出现了不同的死亡情况。在浸泡标记期间，标记组死亡3尾，对照组死亡2尾；在60 d的恢复养殖期间，标记组死亡6尾，对照组死亡8尾。同时随着恢复取样天数的增加，对照组和标记组鱼的体重和全长整体上均呈现增长趋势(图2)。在浸泡后恢复养殖过程中标记组和对照组平均体重和平均全长之间均不存在显著性差异(P>0.05)。

图2

图2 　恢复饲养期间草鱼仔鱼平均体重和平均全长变化 Fig. 2 　Changes in mean body weight and mean total length of larval grass carps during the days of resuming feeding after immersion

以耳石中的Sr绝对含量对3类耳石的标记特征进行分析(图3)，可以看到在浸泡结束恢复养殖第0天取样时，标记组的微耳石和矢耳石Sr含量均已出现了明显的上升趋势，其中部分个体的Sr绝对含量甚至在达到峰值后，出现了一定的下降趋势。对照组矢耳石和微耳石的Sr含量则一直处于较稳定的状态。在浸泡结束恢复养殖第60天取样，也就是本次实验中最后一次取样时，标记组的矢耳石和微耳石均经历了一个完整的Sr绝对含量上升，到达峰值，而后下降到标记前水平的过程。星耳石与矢耳石、微耳石的Sr标记峰值出现位置不同，其标记峰值在最开始核心处出现后，逐渐下降到和对照组Sr含量相同的一个稳定状态。微耳石和矢耳石峰值时的Sr含量接近，均远远大于星耳石。同时在对照组中整个阶段中的矢耳石和微耳石的Sr含量也均大于星耳石。随后对标记组恢复养殖第5天至第60天的3类耳石Sr含量进行分析(图4)，可以看到在恢复养殖第5天时，3类耳石的Sr含量均已经历了峰值，基本下降到和标记前一样的水平。在第10天至第50天的整个恢复养殖过程中，3类耳石的Sr含量峰值未出现明显的波动，在峰值下降后的恢复养殖过程中，Sr含量与对照组相一致，始终处于稳定的状态。

图3

图3 　恢复饲养过程中标记组和对照组第0天及第60天草鱼仔鱼耳石的Sr绝对含量变化在图中标注的样本名称中，第一个数字0、60表示在浸泡标记完成后的第0和第60天对鱼进行耳石取样并进行分析；第二个数字1、2、3代表用于检测的每尾鱼的顺序；第三个字母，L代表微耳石，S代表矢耳石，A代表星耳石. 最后一个数字0表示对照组. Fig. 3 　Changes in Sr content in otoliths of larval grass carp in marked and control groups at d 0 and d 60 during post-immersion cultureIn the label for each line, the first numbers 0 and 60 indicate that the fish were sampled for otoliths and analyzed on days 0 and 60 after the immersion; the second numbers 1, 2, and 3 represent the order of each fish used in the experiment; and the third letters, “L” for lapillus, “S” for sagitta, and “A” for asteriscus. The last digit 0 means the control group.

图4

图4 　恢复饲养过程中标记组第5、10、15、20、25、30、35、40、50天草鱼仔鱼耳石的Sr绝对含量变化在图中标注的样本名称中，第一个数字5、10、15、20、25、30、35、40、50表示在浸泡标记完成后对鱼进行耳石取样并进行分析的具体天数；第二个数字1、2、3代表用于检测的每尾鱼的顺序；第三个字母，L代表微耳石，S代表矢耳石，A代表星耳石. Fig. 4 　Changes in Sr content in otoliths of larval grass carp in marked and control groups at d 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 and 50 during post-immersion cultureIn the label for each line, the first numbers 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 and 50 indicate that the fish were sampled for otoliths and analyzed on days 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 and 50 after the immersion; the second numbers 1, 2, and 3 represent the order of each fish used in the experiment; and the third letters, “L” for lapillus, “S” for sagitta, and “A” for asteriscus.

Sr/Ca比值同样也能表明80 mg/L的六水氯化锶溶液对草鱼仔鱼进行2 d浸泡，能够在3类耳石上形成标记信号(图5)，对照组Sr/Ca比值水平无明显变化。在恢复养殖第0天时，锶标记峰值正处于一个上升阶段，部分个体已达到峰值且开始下降。在恢复养殖第60天时，对草鱼仔鱼3类耳石的Sr/Ca比值峰值进行比较，发现矢耳石和微耳石的锶标记峰值要远远高于星耳石，星耳石的锶标记峰值较低，矢耳石和微耳石锶标记峰值接近。此外，星耳石的锶标记峰值出现在线分布检测的核心处，矢耳石和微耳石的Sr/Ca比值在出现峰值前存在一段稳定阶段，随后Sr/Ca比值开始升高，达到最大值后，又逐渐下降至稳定阶段。在对照组中，Sr/Ca比值始终处于稳定状态的矢耳石、微耳石的Sr/Ca比值也远远大于星耳石。

图5

图5 　恢复饲养过程中标记组和对照组第0天及第60天草鱼仔鱼耳石的Sr/Ca比值特征在图中标注的样本名称中，第一个数字0、60表示在浸泡标记完成后的第0和第60天对鱼进行耳石取样并进行分析；第二个数字 1、2、3代表用于检测的每尾鱼的顺序；第三个字母，L代表微耳石，S代表矢耳石，A代表星耳石。最后一个数字0表示对照组. Fig. 5 　Characteristics of Sr/Ca ratio in otoliths of marked and control group of larval grass carp at d 0 and d 60 during post-immersion cultureIn the label for each line, the first numbers 0 and 60 indicate that the fish were sampled for otoliths and analyzed on days 0 and 60 after the immersion; the second numbers 1, 2, and 3 represent the order of each fish used in the experiment; and the third letters, “L” for lapillus, “S” for sagitta, and “A” for asteriscus. The last digit “0” means the control group.

在对标记组恢复养殖第5天至第50天的耳石Sr/Ca比值进行观察时(图6)，与Sr含量观测结果一致。第5天时，Sr/Ca比值峰值已经下降，且基本达到标记前水平。一直到第60天取样的恢复养殖过程中，耳石的Sr/Ca比值变化过程均与第5天相似，且Sr/Ca比值也未出现明显的波动。

图6

图6 　恢复饲养过程中标记组第5、10、15、20、25、30、35、40、50天草鱼仔鱼耳石的Sr/Ca比值特征在图中标注的样本名称中，第一个数字5、10、15、20、25、30、35、40、50表示在浸泡标记完成后对鱼进行耳石取样并进行分析的具体天数；第二个数字1、2、3代表用于检测的每尾鱼的顺序；第三个字母，L代表微耳石，S代表矢耳石，A代表星耳石. Fig. 6 　Characteristics of Sr/Ca ratio in otoliths of marked and control group of larval grass carp at d 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 and 50 during post-immersion cultureIn the label for each line, the first numbers 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 and 50 indicate that the fish were sampled for otoliths and analyzed on days 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 and 50 after the immersion; the second numbers 1, 2, and 3 represent the order of each fish used in the experiment; and the third letters, “L” for lapillus, “S” for sagitta, and “A” for asteriscus.

草鱼仔鱼耳石上Sr/Ca比值面分布与线分布特征所呈现的结果基本一致(图7)。浸泡结束后恢复养殖40 d时，在耳石面分布图上可直观观察到在标记组的矢耳石和微耳石上中央区域都有一个低Sr的蓝色阶段，随后产生了高Sr的红色标记阶段。但是在星耳石上，红色的“Sr标记区”出现在核心处，这与星耳石在一开始出现的Sr含量或者Sr/Ca比值峰值相一致。在红色的高Sr标记外，在3类耳石上均能明显观察到黄绿色的标记环，随后随着恢复养殖时间的增加，整个星耳石的面分布图呈现深蓝色，而矢耳石和微耳石则呈现蓝绿色。此时耳石Sr/Ca比值恢复至正常水平，外源Sr在耳石上的沉积结束。

图7

图7 　恢复饲养过程中标记组草鱼仔鱼耳石的面分布图以恢复饲养40 d为例. Fig. 7 　Mapping of otoliths in marked group of larval grass carp during post-immersion culture40 d of post-immersion culture as an example.

浸泡标记完成后恢复饲养第5天的草鱼仔鱼实际为16日龄，第10天的草鱼仔鱼实际为21日龄。对恢复养殖第5天的矢耳石、第10天的微耳石及星耳石日轮数目进行观察并计数(图8)，在微耳石上可以清晰地看到日轮数为20，在矢耳石上可以清晰地看到日轮数为15，即草鱼的矢耳石和微耳石在孵化完成后第2天形成第1日轮，在星耳石观测到日轮数为10，即草鱼的星耳石在孵化完成后第12天形成第1日轮，星耳石的第一日轮形成时间不同于微耳石和矢耳石。草鱼仔鱼在浸泡标记当日为第9日龄，经过2 d浸泡后，草鱼仔鱼为11日龄。在微耳石和矢耳石上可以观察到标记环出现在第9~11日轮上，分别对应第10~12日龄的草鱼仔鱼，也就是说锶标记开始形成与浸泡出现及锶标记消失与浸泡结束分别存在1 d的时间差。在星耳石上观察到标记出现在耳石核心处，标记环出现在第1日轮上，对应第12日龄的草鱼仔鱼，即锶标记消失与浸泡结束存在1 d的时间差。

图8

图8 　扫描电镜下草鱼仔鱼三类耳石日轮照片a. 恢复养殖第10天的微耳石；b. 恢复养殖第5天的矢耳石；c. 恢复养殖第10天的星耳石.数字代表日轮数. Fig. 8 　Photograph of the three types of otoliths of larval grass carp in scanned electron microscopica. Lapillus from the 10th d of post-immersion culture, b. Sagitta from the 5th d of post-immersion culture, c. Asteriscus from the 10th d of post-immersion culture. The numbers on the otoliths indicate the counting of the daily rings.

在淡水中，与钡(Ba)类似，Sr可以在CaCO₃基质中取代Ca，并随着时间的推移表现出稳定的特征^[19]。无论是从Sr绝对含量的角度分析，还是从Sr/Ca比值上分析，均能证实本研究中80 mg/L的六水氯化锶对草鱼仔鱼进行2 d浸泡能够很好地在3类耳石上产生明显标记，且两种分析方法得到的结果相同。不同的耳石由不同的CaCO₃多态类型形成，即文石、球文石和方解石^[27]，不同多态类型的分布系数不同。球文石的元素浓度通常低于文石^[28]，然而星耳石大部分是由球文石构成的^[29]，矢耳石和微耳石则通常是由文石构成的^[30]，这也就解释了为什么在未标记的对照组中矢耳石和微耳石的Sr绝对含量以及Sr/Ca比值均高于星耳石的原因。同时在面分布中，也能看到在经历过标记峰值后的星耳石整个面都呈现出低浓度的深蓝色，而矢耳石和微耳石在峰值下降后的生长过程中整个面则呈现出略高浓度的蓝绿色。在大多数的鱼类锶标记研究中，通常都以单一耳石作为研究对象，如邱晨等^[31]以鲤的星耳石为研究对象，司飞等^[32]以牙鲆的矢耳石为研究对象，在本实验中，通过对3类耳石的标记信号强度检测以及取样的难易程度进行比较，发现微耳石是更为适宜用来做草鱼锶标记检测的对象。这与Zhu等^[33]在鲫耳石锶标记中的结果一致；因此，在接下来针对其他鱼类的相关研究中，建议对3类耳石的锶标记差异进行比对分析，以挑选出最适宜用来鉴定Sr标记效果的代表性耳石类型。

此前普遍认为，耳石在鱼体孵化时就已形成，此时耳石一般指鱼体的3类耳石。在本次草鱼仔鱼实验中，在浸泡标记后第0天取样的时候，矢耳石、微耳石都能成功取到，但是未成功取到星耳石。从浸泡标记的线分布结果来看，星耳石首先出现的是锶标记高峰，随后随着养殖时间的增加，Sr绝对含量或者是Sr/Ca比值才开始逐渐下降。同样在面分布结果中，星耳石的红色锶标记区域出现在核心处，其标记区域形成阶段与矢耳石和微耳石完全不同，这一切均证实了星耳石是后期形成的，并不是在鱼体孵化的阶段就存在，很可能是在对鱼体进行浸泡的过程中，星耳石逐渐形成，并在核心处形成标记。因此在付自东等^[34]用茜素络合物对胭脂鱼仔鱼进行浸泡标记时，由于12日龄的胭脂鱼星耳石尚未形成，因此也未在恢复饲养后的星耳石上检测到荧光标记环。在李茂华等^[35]用荧光染料对短须裂腹鱼早期鱼苗进行浸泡标记时，由于8日龄的短须裂腹鱼仅有部分个体的星耳石原基形成，也未对星耳石进行分析。在对草鱼仔鱼进行锶标记观察时，特别是在后期需要进行日轮推算日龄时，应尽量避免使用星耳石，考虑到取样过程中的难易程度及3类耳石形成时间的差异性，推荐微耳石作为草仔鱼锶标记观察的首选类型。

元素从环境沉积到耳石中是一个多阶段的过程。元素通过离子转运从血浆进入内耳的内淋巴，最后沉积在耳石表面^[36]。在这个过程中，某种元素从进入鱼体到沉积在耳石中会有一定的时间延迟。通常，特定的时间延迟发生在浸入开始和3种类型耳石的标记信号产生之间，以及浸入结束和标记信号终止之间，即时间(例如日期)对于前者和后者而言彼此不相等。Brown等^[37]使用外源Sr浸泡金鲈，发现直到标记后培养的第20天才能检测到Sr标记。在日本鳗的Sr标记中，耳石中Sr/Ca比值的变化在10 d后可见，而耳石中的完全沉积至少需要30~60 d^[38]。邱晨等^[31]在对鲤仔鱼锶标记的研究发现在开始浸泡后的第3天，耳石上才开始出现锶标记，在浸泡结束后的第6天，耳石锶标记才会完全消失。同时Zhu等^[33]在之前对鲫3类耳石的锶标记时滞进行研究时，发现鲫微耳石和矢耳石上信号的产生与浸泡开始存在2 d的时间差，星耳石则表现为1 d，而微耳石和矢耳石信号完全消失则需要16 d，星耳石为12 d。在本实验中，草鱼仔鱼微耳石锶标记信号的产生与消失与浸泡的开始与结束均存在1 d的时间差，同时星耳石锶标记信号的消失与浸泡结束也存在1 d的时间差，相比之下时滞时间较短，这可能是因鱼类、生长阶段和水环境差异而造成的。为了更好地了解标记过程并客观准确地评估标记效果，耳石取样应避免浸泡的开始和结束，因为在这些时期耳石Sr标记可能尚未开始或完成。这种时间延迟的机制必须根据不同鱼类的Sr沉积和耳石结构^[29]并结合水环境的基本特征，如盐度^[39]和温度^[40]进一步研究。其他生物学因素，如鱼类遗传学、发育阶段、生长速度、食物和生理条件，也会影响Sr在耳石中沉积的时间滞后^[41]。未来对不同物种耳石中Sr沉积机制的研究将有助于改进Sr标记方法。

本实验利用X射线电子探针微区分析仪(EPMA)对80 mg/L的SrCl₂·6H₂O浸泡标记2 d的草鱼仔鱼耳石样本进行分析，定量线分析结果表明其能够在草鱼仔鱼耳石上形成锶标记峰值，微耳石和矢耳石的最大锶标记峰值远远大于星耳石，随着恢复饲养时间的增加，锶标记高峰逐渐下降至正常水平，在3类耳石未标记的正常生长阶段，微耳石和矢耳石的Sr/Ca比值也大于星耳石。由标记峰值出现的特征进一步证实在草鱼仔鱼3类耳石中，星耳石的形成时间不同于微耳石和矢耳石。从鱼体死亡率、行为学上来看，本实验设计的Sr剂量范围对实验鱼的生存和生长无显著影响。考虑到标记检测最优效果及耳石取样的难易程度，微耳石可作为观测草鱼仔鱼Sr标记最适合的耳石样本，此结果可为水产养殖实践中增殖放流的标记检测提供理论依据及技术支撑，同时为以不同的研究目的选择3类耳石之一作为研究对象提供了新的思路。