中国水产科学  2024, Vol. 31 Issue (07): 766-779  DOI: 10.12264/JFSC2024-0115
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引用本文 

杜国儒, 解伟, 左佳俊, 刘伟, 王雪惠, 隋丽英. 驱动蛋白基因调节克氏原螯虾血淋巴细胞的吞噬作用[J]. 中国水产科学, 2024, 31(7): 766-779. DOI: 10.12264/JFSC2024-0115.
DU Guoru, XIE Wei, ZUO Jiajun, LIU Wei, WANG Xuehui, SUI Liying. Kinesin-related genes regulate phagocytosis in Procambarus clarkii hemocytes[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2024, 31(7): 766-779. DOI: 10.12264/JFSC2024-0115.

基金项目

天津市科技计划项目(22YFZCSN00200);天津市海洋资源与化学重点实验室(天津科技大学)开放基金资助项目(202303).

作者简介

杜国儒(1996‒),男,硕士研究生,研究方向为生物信息学. E-mail:21818020@mail.tust.edu.cn

通信作者

通信作者:隋丽英,教授,研究方向为卤水生态与生物资源利用. E-mail:suily@tust.edu.cn

文章历史

收稿日期:2024-04-09
修改日期:2024-06-04
驱动蛋白基因调节克氏原螯虾血淋巴细胞的吞噬作用
杜国儒1,解伟1,左佳俊2,刘伟1,王雪惠3,隋丽英1,     
1. 天津科技大学海洋与环境学院,海洋资源化学与食品技术教育部重点实验室,亚洲区域卤虫参考中心,天津市海洋资源与化学重点实验室,天津 300457
2. 沈阳农业大学动物科学与医学学院,辽宁 沈阳 110866
3. 天津市水产研究所,天津 300221
摘要:为探究克氏原螯虾(Procambarus clarkii)免疫调节作用的分子机制,本研究分析了与3-羟基丁酸共培养的克氏原螯虾的血淋巴细胞转录组数据,发现细胞骨架基因呈显著的差异表达,推测其可能与克氏原螯虾的免疫调节相关。本研究对细胞骨架基因进行注释,并验证了其对细胞免疫调节的影响。注释结果显示,5个细胞骨架基因中4个为驱动蛋白超家族(kinesin family,KIF)基因,均含有KISc结构域,且编码氨基酸以谷氨酸、亮氨酸为主,蛋白质二级结构主要由α-螺旋组成。各物种中除kinesin-like protein的保守结构域及保守基序数量、种类和位置有所差别,其余KIFs基因大致相同。qRT-PCR结果表明,KIFs基因在克氏原螯虾的造血组织和鳃中表达量较高,在眼柄、肌肉等组织中表达较低(P<0.05)。RNAi结果证明,0.10 μg/g体重剂量dsKIF11的敲降效果最佳,可将KIF11的表达量敲降至8.01%(P<0.05);与对照组相比,随着KIF11基因的敲降,血淋巴细胞对FITC标记的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和红色荧光微球的吞噬率分别下降36.26%(P<0.01)和41.94%(P<0.01)。上述结果表明KIFs基因保守性较高,参与了血淋巴细胞的吞噬作用,这一结果为深入研究KIFs基因在先天免疫中的功能和机制提供了依据。
关键词克氏原螯虾    血淋巴细胞    驱动蛋白    吞噬作用    免疫    
Kinesin-related genes regulate phagocytosis in Procambarus clarkii hemocytes
DU Guoru1,XIE Wei1,ZUO Jiajun2,LIU Wei1,WANG Xuehui3,SUI Liying,1    
1. Key Laboratory of Marine Resource Chemistry and Food Technology (TUST), Ministry of Education; Asian Regional Artemia Reference Center; Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry; College of Marine and Environmental Sciences, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China
2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China
3. Tianjin Fisheries Research Institute, Tianjin 300221, China
Abstract: Procambarus clarkii is an economically important aquaculture species in China, and pathogens, especially Vibrio parahaemolyticus, have caused significant economic losses in large-scale farming. However, the mechanism of the immune system response to pathogen invasion remains unclear. To delve into the molecular mechanisms behind the immune regulation of the Procambarus clarkii, this study analyzed the transcriptome data of its hemocytes that had been co-cultured with 3-hydroxybutyrate. By analyzing the transcriptome data of hemocytes from P. clarkii co-cultured with 3-hydroxybutyrate, significant differential expression of cytoskeleton genes was observed, suggesting a potential association with immune regulation in P. clarkii. This study annotated and classified cytoskeleton genes and validated their impact on cellular immune regulation. The annotation results showed that out of five cytoskeleton genes, four belonged to the kinesin family (KIF). All contained KISc domains, and they encoded amino acids primarily composed of glutamate and leucine. The secondary protein structure was mainly composed of α-helices. The genes encoding KIFs were generally similar across species, except for variations in the number, type of conserved motifs, and gene structure among kinesin-like-protein genes in different species. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction results showed that the expression levels of KIFs were higher in the hemopoietic tissues and gills of P. clarkii than in tissues such as eyestalks and muscles (P<0.05). RNA interference results demonstrated that the optimal knockdown effect was achieved with a dose of 0.10 μg/g body weight of dsKIF11, reducing the expression level of KIF11 to 8.01% of its normal level (P<0.05). Moreover, compared to the control group, after the knockdown of the KIF11 gene, the phagocytic rates of hemocytes towards green-fluorescence-labeled V. parahaemolyticus and red fluorescent microspheres decreased by 36.26% (P<0.01) and 41.94% (P<0.01), respectively. The abovementioned results indicate that KIFs exhibit high conservation and are involved in the phagocytic activity of hemocytes. This finding provides a basis for further investigation of the function and mechanism of KIFs in innate immunity.
Key words Procambarus clarkii     hemocyte    kinesin    phagocytosis    immune    

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)又称小龙虾,隶属甲壳动物亚门、螯虾科、原螯虾属[1]。其繁殖能力强,蛋白含量高,脂肪含量低,是营养价值较高的动物性食品[2],也是我国重要的淡水养殖品种[3]。克氏原螯虾的生存环境中存在多种能导致个体死亡并影响群体的病原体[4-5]。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)能引发虾类的急性肝胰腺坏死症,导致克氏原螯虾的肝胰腺上皮细胞萎缩、坏死和脱落,进而造成肝胰腺变薄和塌陷[6],威胁着克氏原螯虾的规模化养殖。因此,认识克氏原螯虾的免疫能力,研究其抵御副溶血弧菌的作用机制,对实现克氏原螯虾的健康养殖有重要意义。

细胞免疫是虾蟹类动物应对病原入侵的重要防御机制,主要依靠血淋巴细胞对外来异物的吞噬、凝集、包囊化、胞吐和形成结节等方式实现免疫应答过程[7-9]。虾蟹类甲壳动物的血淋巴细胞可分为透明细胞(hyaline cells)、半颗粒细胞(semi-granular cells)和颗粒细胞(granular cells),其中由透明细胞和半颗粒细胞介导的吞噬作用被认为是血淋巴细胞最重要的免疫防疫机制[10]。而吞噬作用与细胞膜的流动性有关[11],故推断细胞膜的生理状态变化可能调节了免疫细胞的免疫过程。

真核细胞骨架由微管(microtubule)、微丝(microfilament)及中间纤维(intermediate filament)组成,是真核生物细胞中蛋白质之间搭建的网络结构体系[12]。驱动蛋白是基于微管的运动蛋白,参与细胞运动、细胞器的胞内运输以及细胞骨架重塑等过程[13]。目前,共发现有14种驱动蛋白超家族(kinesin family, KIF)[14],这些驱动蛋白通过调节微管动态[15]和胞质分裂[16]来调控机体免疫能力。Belabed等[17]研究表明,异常表达的kinesin-1可以通过调节小鼠的树突状细胞的交叉呈递降低其抗肿瘤能力;黄飞翔等[18]和李涛等[19]证明KIF18BKIF14的表达与细胞的增殖和抗凋亡能力成正相关。另有研究推测细胞骨架蛋白驱动了神经元等细胞形状的高可塑性[20],以及驱动蛋白可以向细胞膜运输蛋白质等物质,还具有和肌动蛋白相似的功能,即影响细胞膜的张力和形态改变等[21]。上述结果表明KIFs基因的异常表达不仅可影响机体免疫力,还会影响细胞膜的功能,进而影响机体对致病菌的耐受能力。

但在水生动物中对KIFs基因的研究较少,仅在海水鲆鲽鱼类褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)中被报道。研究发现microRNA pol-miR-140-3p的下调能诱导褐牙鲆KIF5A的表达,以对抗副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)感染,证明在褐牙鲆中驱动蛋白也与机体免疫和抵抗病原感染有关[22]。因此探究KIFs基因在克氏原螯虾先天免疫中的作用并明确其分子机制,对免疫促进剂的开发和克氏原螯虾的健康养殖具有参考意义。

课题组前期将免疫促进剂3-羟基丁酸(3-hydroxybutyrate, 3-HB)与克氏原螯虾分别共培养0、3、6、12和24 h,获得血淋巴细胞并进行RNA测序,通过转录组数据分析获得了5个差异表达的细胞骨架基因[23]。为探究其在先天免疫中的作用,本研究对这5个细胞骨架基因进行生物信息学分析、组织分布分析和功能验证,旨在初步阐明克氏原螯虾细胞骨架基因在细胞免疫中的作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物及数据来源

克氏原螯虾购于农贸市场,平均体重(23.53± 1.75) g,平均体长(9.21±0.50) cm。将挑选的健康克氏原螯虾置于16~18 ℃养殖箱中,喷水使之保持湿润,每天投喂1次,暂养1周。

课题组前期已获得3-HB与克氏原螯虾共培养后的RNA数据,并通过差异表达分析和富集分析,获得了5个细胞骨架基因(Cluster-32372.74405、Cluster-32372.26862、Cluster-32372.109731、Cluster-32372.71950和Cluster-32372.87767)可能在3-HB调控的免疫过程中发挥作用[23],并开展如下研究。

1.2 细胞骨架基因生物信息学分析 1.2.1 细胞骨架基因氨基酸序列属性分析

使用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)在线工具对相关基因的理化性质及氨基酸组成进行分析。通过SOPMA在线程序(http://npsa-pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)对5个基因的二级结构进行预测,利用网站SMART (http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)预测基因的结构域。

1.2.2 细胞骨架基因序列比对及系统进化树构建

通过NCBI的blastp子程序下载以上5个基因的同源序列,并利用DNAMAN (v6)进行序列保守性比对,再以MEGA 10.2软件采用邻接法(neighbor joining, NJ)构建系统发育树。参数设置:替换模型设置为“Possion model”,缺口设置为“Pairwise deletion”,校验参数设置为bootstrap method=1000。并将在线工具MEME (http://meme-suite.org/tools/ meme)统计分析获得的蛋白序列的保守性基序(基序数量上限为10,其他值均为默认值)和利用NCBI子程序Batch CD-Search (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)获得的保守结构域通过TBtools-Ⅱ1.120进行可视化。

1.3 基因组织分布

随机选取15尾健康的克氏原螯虾个体,分别收集血淋巴细胞、肠道、肝胰腺、鳃、造血组织、肌肉及眼柄等组织,以5个个体的相同组织作为1个混池。提取各组织总RNA,反转录后,利用qRT-PCR检测相关基因在各个组织中的表达水平[23]

1.4 RNAi实验

利用Primer Premier 5.0软件设计合成KIF11KIF20KIF23基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的dsRNA引物(表1),采用文献报道的方法合成相应dsRNA[24]。分别设置对照组(EGFPdsRNA)和实验组(KIF11KIF20KIF23 dsRNA),每组5尾克氏原螯虾。用CPBS将dsEGFP、dsKIF11、dsKIF20、dsKIF23的浓度分别调整为0.05、0.10、0.20 μg/g体重剂量。随后将dsRNA溶液从第2腹节左侧腹面注入克氏原螯虾体内,每尾虾注射100 μL后置于培养箱中暂养。注射dsRNA后每隔12 h从第2腹节抽取血淋巴液,直至72 h。离心收集血淋巴细胞提取RNA,应用qRT-PCR检测最佳干扰剂量与作用时效。并收集培养以0.10 μg/g体重剂量干扰克氏原螯虾后的血淋巴细胞,用于吞噬率检测。

表1  dsRNA引物序列 Tab. 1  dsRNA primer sequence
1.5 细菌培养及FITC标记

副溶血弧菌来源于自然资源部第三海洋研究所。使副溶血弧菌在含有酵母提取物1.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、牛肉膏1.0 g/L和30盐度稀释卤水(pH 7.4~7.6)的2216E培养基中以28 ℃、150 r/min培养至对数期。

收集5 mL对数期副溶血弧菌培养物,并在12000 g、4 ℃下离心5 min (Eppendorf 5424R, Germany)。用PBS将细胞颗粒重悬浮并洗涤3次。用DMSO将FITC染液浓度调节成5 mg/mL,按照菌液∶FITC混合液=25∶1的体积比混匀溶液,避光孵育24 h后,12000 g离心5 min,弃上清。以PBS重悬并洗涤5次。

1.6 血淋巴细胞培养及Hoechst 33342标记

以75%乙醇清洗消毒克氏原螯虾体表,用5 mL无菌注射器以血淋巴与抗凝剂2∶3的体积比吸取预冷柠檬酸EDTA抗凝剂后从第2腹节采集克氏原螯虾血淋巴,立即在1000 g、4 ℃下离心5 min。弃上清后,用L-15培养基(11415114, Life Technologies Europe, USA)将血淋巴细胞颗粒重悬浮并调整密度至106 CFU/mL,将培养基放置于24孔板上,在22 ℃下培养。将Hoechst按1 μg/mL剂量添加到贴壁生长的细胞中,避光孵育15 min后用L-15培养基洗涤3次,倒置荧光显微镜(Nikon, Japan)下观察被染色的血淋巴细胞。

1.7 基因功能验证

以最佳干扰剂量的dsKIF11、dsKIF20、dsKIF23及相应剂量的dsEGFP对克氏原螯虾进行体内注射,48 h后收集并培养血淋巴细胞,待细胞爬片(Thermo Fisher)生长后,按照血淋巴细胞∶副溶血弧菌/荧光微球=10∶1的体积比加入FITC标记的副溶血弧菌或0.5 μm荧光微球(fluorescent microsphere, Polysciences, USA)并充分混匀,避光孵育2 h后清洗3次以去除未被吞噬的副溶血弧菌或荧光微球,随后向贴壁生长的血淋巴细胞中加入1 μg/mL Hoechst以标记血淋巴细胞细胞核,避光孵育15 min后用L-15培养基清洗3次以洗净染剂,倒置荧光显微镜下观察并拍照、统计各组血淋巴细胞吞噬率,每组血淋巴细胞选取5个视野进行统计,每个视野下细胞数不少于100。

1.8 数据处理

本研究采用2‒∆∆Ct计算目的基因的mRNA表达水平。数据采用单因素方差分析(ANOVA),采用Levene检验和Duncan多重比较检验。P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析 2.1 细胞骨架相关基因的理化性质

5个细胞骨架基因中,4个(Cluster-32372.74405、Cluster-32372.26862、Cluster-32372.109731、Cluster-32372.71950)被注释为KIFs相关基因;另一个基因(Cluster-32372.87767)被注释为螺旋-环-螺旋(helix loop helix)亮氨酸拉链转录因子MiT家族的转录因子EB (transcription factor EB, TFEB)。各基因编码蛋白注释信息、氨基酸数目及等电点见表2。氨基酸类型分析结果表明,5个基因中谷氨酸(Glu)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、丝氨酸(Ser)含量较高(图1 a)。蛋白质二级结构分析结果显示,5个基因的结构相似,主要由α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和延伸链构成,且α-螺旋和无规则卷曲是蛋白质二级结构的主要组成部分(图1b)。

表2  克氏原螯虾细胞骨架基因相关蛋白信息 Tab. 2  Cytoskeleton gene-related proteins information in Procambarus clarkii
图1  克氏原螯虾5个细胞骨架基因的理化性质a. 主要编码氨基酸含量;b. 二级结构预测. Fig. 1  Physicochemical properties of five cytoskeletal genes in Procambarus clarkiaa. Main coded amino acid content; b. Secondary protein structure prediction.
2.2 KIFs基因同源性分析

蛋白结构域预测结果显示,KIF23 (Cluster-32372.26862)、KIF11 (Cluster-32372.74405)、KIF20 (Cluster-32372.109731)和kinesin-like protein (Cluster-32372.71950)均含有1个KISc结构域(附图1)。利用DNAMAN软件对5个细胞骨架基因与其他10个物种对应基因的氨基酸组成进行比对,发现KIF23KIF20KIF11这3组基因在10个物种中的同源性分别为67.42%、48.22%和46.61%;而TFEB与kinesin-like protein在10个物种中的同源性仅为36.21%与21.70%。KIF11氨基酸序列与红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)的同源性更高,同源性为75.40%; KIF23KIF20和TFEB的氨基酸序列与美洲龙虾(Homarus americanus)的同源性更高,分别为77.13%、59.77%和55.52%; kinesin-like protein与日本对虾(Penaeus japonicus)的同源性最高,为36.46% (附图2)。

图1 附 克氏原螯虾细胞骨架基因编码蛋白的保守结构域a. KIF11; b. KIF20; c. KIF23; d. kinesin-like protein; e. TFEB. Appendix 1 Conserved structural domains of cytoskeletal gene encoding protein in Procambarus clarkiaa. KIF11; b. KIF20; c. KIF23; d. kinesin-like protein; e. TFEB.
图2 附 克氏原螯虾细胞骨架基因编码蛋白与其他物种的氨基酸序列比对 Appendix 2 Amino acid sequence comparison of cytoskeletal gene encoding protein in Procambarus clarkii with those of other species
2.3 KIFs基因系统发育分析

利用MEGA 10.0对5个细胞骨架基因及同源性最高的10个物种的氨基酸序列应用邻接法建立系统发育树,并通过TBtools软件将其与预测的motif及保守结构域分析结果相结合(图2)。克氏原螯虾KIF11KIF20均与红螯螯虾KIF11KIF20聚为一支,克氏原螯虾KIF23与美洲龙虾KIF23聚为一支,而克氏原螯虾kinesin-like protein与TFEB则与中国明对虾(Penaeus chinensis)、斑节对虾(Penaeus monodon)、日本对虾(Penaeus japonicus)及美洲龙虾聚为一簇。通过MEME在线工具对以上3组序列进行保守型基序预测,共鉴定10个不同的保守基序,除KIF11组及KIF20组的1个同源基因外,3组KIFs基因含有相同的motif数量,保守结构域的位置和种类差异较小,相对保守,kinesin-like protein和TFEB两组基因motif的数量有部分差异,且保守结构域的位置和种类差异较大。

图2  克氏原螯虾5个细胞骨架基因的系统发育分析a. KIF11; b. KIF20; c. KIF23; d. Kinesin-like protein; e. TFEB. Fig. 2  Phylogenetic analysis of five cytoskeleton genes in Procambarus clarkiaa. KIF11; b. KIF20; c. KIF23; d. Kinesin-like protein; e. TFEB.
2.4 细胞骨架相关基因的组织分布

克氏原螯虾各组织中细胞骨架相关基因的表达水平分析结果显示,KIF23、kinesin-like protein和KIF20在造血组织中表达量最高(P<0.05); KIF11和TFEB在鳃、造血组织中的表达量最高(P<0.05)(图3)。

图3  5个细胞骨架基因在克氏原螯虾中的组织表达分析同一基因不同字母表示组织间存在显著差异(P<0.05). Fig. 3  Tissue distribution of five cytoskeleton genes in Procambarus clarkiaDifferent letters on the same gene indicate significant differences between tissues (P<0.05).
2.5 KIFs基因最佳敲降剂量及作用时效探究

分组对克氏原螯虾注射dsRNA, 48 h后抽取血淋巴液,离心收集血淋巴细胞并提取RNA,反转录后检测基因表达水平。结果显示,0.05~0.20 μg/g体重剂量的dsKIF11、dsKIF20和dsKIF23均可极显著敲降KIF11KIF20KIF23的表达(P<0.01)。与对照组相比,dsKIF11的最佳干扰剂量为0.10 μg/g体重剂量,可将KIF11表达量敲降至8.01% (P<0.01); dsKIF20和dsKIF23的最佳干扰剂量均为0.05 μg/g体重剂量,可分别将KIF20KIF23表达量敲降至30.45%和18.07% (P<0.01)(图4)。

图4  克氏原螯虾KIF11、KIF20及KIF23基因的最佳敲降剂量探究**表示差异极显著(P<0.01). Fig. 4  Investigation of the optimal knockdown dose of KIF11, KIF20 and KIF23 genes in Procambarus clarkii** indicates extremely significant difference (P<0.01).

对克氏原螯虾注射0.10 μg/g体重剂量的dsKIF11及dsEGFP后,每隔12 h取螯虾血淋巴细胞直至72 h,提取RNA并反转录检测KIF11表达水平。结果显示,0.10 μg/g体重剂量的dsKIF11从48 h起显著敲降KIF11表达(P<0.05),且可持续至72 h。注射dsKIF11 12~72 h后KIF11表达水平分别为相应时间点注射dsEGFP组的213.01%、94.30%、88.58%、6.12% (P<0.05)、11.31% (P<0.05)和17.97% (P<0.05)(图5)。

图5  注射0.10 μg/g体重剂量dsKIF11后12、24、36、48、60和72 h 时克氏原螯虾KIF11的相对表达水平**表示差异极显著(P<0.01). Fig. 5  Relative expression levels of KIF11 after injection of 0.10 μg/g body weight dose of dsKIF11 in Procambarus clarkii at 12, 24, 36, 48, 60 and 72 h** indicates extremely significant difference (P<0.01).
2.6 KIFs基因的敲降显著降低血淋巴细胞的吞噬作用

在倒置荧光显微镜下分别在激发光波长为346、495及535 nm观察到FITC标记的副溶血弧菌显现绿色、荧光微球显现红色、Hoechst 33342标记的细胞核显现蓝色(图6)。蓝色的细胞核周围环抱着绿色副溶血弧菌和红色荧光微球,说明细胞核对外源入侵物质正在进行或已经吞噬。

图6  荧光显微镜下克氏原螯虾血淋巴细胞吞噬副溶血弧菌及荧光微球a. 副溶血弧菌;b. 荧光微球;c. 血淋巴细胞;d.副溶血弧菌与血淋巴细胞,白色方框指示位置为吞噬副溶血弧菌的血淋巴细胞;e. 荧光微球与血淋巴细胞,白色方框指示位置为吞噬荧光微球的血淋巴细胞;f. 副溶血弧菌、荧光微球与血淋巴细胞,白色方框指示位置为同时吞噬副溶血弧菌及荧光微球的血淋巴细胞. Fig. 6  Phagocytosis of Vibrio parahaemolyticus and fluorescent microspheres by Procambarus clarkii hemocytes observed under fluorescence microscopya. Vibrio parahaemolyticus; b. Fluorescent microspheres; c. Hemocytes; d. V. parahaemolyticus and hemocytes, the white box indicates phagocytosis of V. parahaemolyticus; e. Fluorescent microspheres and hemocytes, the white box indicates the phagocytosis of fluorescent microspheres; f. V. parahaemolyticus, fluorescent microspheres and hemocytes, the white box indicates phagocytosis of fluorescent microspheres and V. parahaemolyticus.

吞噬率统计结果显示,注射dsRNA 48 h后dsEGFP组克氏原螯虾血淋巴细胞对副溶血弧菌和荧光微球的吞噬率分别为(16.96±1.08)%和(22.46±2.18)% (图7); dsKIF11组血淋巴细胞对副溶血弧菌和荧光微球的吞噬率分别为(10.81± 1.66)%和(13.04±1.31)%,均极显著低于dsEGFP组(P<0.01); dsKIF20组血淋巴细胞对副溶血弧菌和荧光微球的吞噬率分别为(14.61±0.65)%和(18.09± 0.74)%,其中对荧光微球的吞噬率显著低于dsEGFP组(P<0.05); dsKIF23组血淋巴细胞对副溶血弧菌和荧光微球的吞噬率分别为(12.66± 1.20)%和(16.37±1.68)%,均显著低于dsEGFP组(P<0.05)。

图7  克氏原螯虾KIFs基因敲降后血淋巴细胞对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)及荧光微球(fluorescent microspheres, Fm)的吞噬率*表示差异显著(P<0.05); **表示差异极显著(P<0.01). Fig. 7  Phagocytosis of Vibrio parahaemolyticus (Vp) and fluorescent microspheres (Fm) by hemocytes after KIFs gene knockdown in Procambarus clarkia* indicates significant difference (P<0.05); ** indicates extremely significant difference (P<0.01).
3 讨论 3.1 KIFs基因具有较高保守性

本研究在5个克氏原螯虾血淋巴细胞的细胞骨架基因中发现了4个KIFs基因,其中谷氨酸和亮氨酸是最丰富的氨基酸种类,α-螺旋和β-折叠是构成该蛋白二级结构的主要成分。这一结果与其他KIFs基因相关研究结果相似,即α-螺旋和β-折叠是组成驱动蛋白马达结构域的主要二级结构[25],且马达结构域中包含着氨基酸结合位点和微管结合位点,其中至少有35%氨基酸序列相同[26]。系统进化树结果显示,所鉴定的4个KIFs基因均与虾、蟹等动物聚为一簇,而与昆虫和端足动物门的动物遗传距离较远,表明这些基因的进化与动物进化过程基本一致。KIF11KIF20KIF23基因与kinesin-like protein不同,所含的保守基序数量较为一致,保守结构域的位置和种类较为相似。研究结果进一步证明了KIFs基因的同源性,推测高度同源的氨基酸组成及相对保守的结构域是KIFs基因行使分子马达功能的基础[27-28],最终通过影响细胞迁移来调控机体的免疫能力。

3.2 KIFs基因的组织分布及敲降后对血淋巴细胞吞噬作用的影响

本研究中,克氏原螯虾血淋巴细胞5个细胞骨架基因在克氏原螯虾的多个组织中均有表达,这可能与细胞骨架基因参与细胞分裂、减数分裂纺锤体的组装和胞内运输等功能相关[29]KIFs基因在造血组织中的表达水平相对较高,这一表达特征与日本沼虾(Macrobrachium nipponense)的C型凝集素结构域家族3基因(Mnlec3)的表达模式相似,该基因有益于甲壳动物对病原识别及识别后的免疫反应[30]。提示在免疫组织中,KIFs基因可能与Mnlec3具有功能相关性,即有益于调节克氏原螯虾抵抗病原菌的能力。

细胞免疫是甲壳动物抵御病原感染的主要方式之一,血淋巴细胞可通过不同的吞噬方式清除外来病原[31],其吞噬能力也是衡量机体健康状况的重要指标[32],而体外培养的原代血淋巴细胞也常用于直接检测其吞噬能力。本研究发现,RNAi技术显著降低了3个KIFs基因的表达,干扰效率为70%~90%,其中dsKIF11的干扰效果最为明显,敲降效率达到91.99%。随着KIF11被敲降,克氏原螯虾血淋巴细胞对副溶血弧菌和荧光微球的吞噬率分别降低了36.26%和41.94%,提示KIF11通过保证血淋巴细胞的吞噬能力,维持克氏原螯虾的自身免疫。这与对SsC1qDC基因的研究结果相似。该基因的敲降显著降低了毛蚶(Scapharca subcrenata)对副溶血弧菌的吞噬作用,导致毛蚶的血细胞凋亡数和个体死亡率显著升高[33]。推测克氏原螯虾血淋巴细胞吞噬能力的下降与KIFs基因直接参与细胞的细胞骨架塑造等过程相关[34]。细胞骨架对支撑细胞形态、维持细胞功能有重要意义[35-36]KIFs基因与肌动蛋白基因是细胞骨架的重要组成部分,两者相互协作,以维持细胞结构正常的动态变化[37]。且对肌动蛋白基因的敲降影响了细胞骨架对细胞膜张力和形态改变的调节作用[21],推测KIFs基因的敲降亦能损伤细胞功能,降低血淋巴细胞对副溶血弧菌及荧光微球的吞噬能力。

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表1  dsRNA引物序列 Tab. 1  dsRNA primer sequence
表2  克氏原螯虾细胞骨架基因相关蛋白信息 Tab. 2  Cytoskeleton gene-related proteins information in Procambarus clarkii
图1  克氏原螯虾5个细胞骨架基因的理化性质a. 主要编码氨基酸含量;b. 二级结构预测. Fig. 1  Physicochemical properties of five cytoskeletal genes in Procambarus clarkiaa. Main coded amino acid content; b. Secondary protein structure prediction.
图1 附 克氏原螯虾细胞骨架基因编码蛋白的保守结构域a. KIF11; b. KIF20; c. KIF23; d. kinesin-like protein; e. TFEB. Appendix 1 Conserved structural domains of cytoskeletal gene encoding protein in Procambarus clarkiaa. KIF11; b. KIF20; c. KIF23; d. kinesin-like protein; e. TFEB.
图2 附 克氏原螯虾细胞骨架基因编码蛋白与其他物种的氨基酸序列比对 Appendix 2 Amino acid sequence comparison of cytoskeletal gene encoding protein in Procambarus clarkii with those of other species
图2  克氏原螯虾5个细胞骨架基因的系统发育分析a. KIF11; b. KIF20; c. KIF23; d. Kinesin-like protein; e. TFEB. Fig. 2  Phylogenetic analysis of five cytoskeleton genes in Procambarus clarkiaa. KIF11; b. KIF20; c. KIF23; d. Kinesin-like protein; e. TFEB.
图3  5个细胞骨架基因在克氏原螯虾中的组织表达分析同一基因不同字母表示组织间存在显著差异(P<0.05). Fig. 3  Tissue distribution of five cytoskeleton genes in Procambarus clarkiaDifferent letters on the same gene indicate significant differences between tissues (P<0.05).
图4  克氏原螯虾KIF11、KIF20及KIF23基因的最佳敲降剂量探究**表示差异极显著(P<0.01). Fig. 4  Investigation of the optimal knockdown dose of KIF11, KIF20 and KIF23 genes in Procambarus clarkii** indicates extremely significant difference (P<0.01).
图5  注射0.10 μg/g体重剂量dsKIF11后12、24、36、48、60和72 h 时克氏原螯虾KIF11的相对表达水平**表示差异极显著(P<0.01). Fig. 5  Relative expression levels of KIF11 after injection of 0.10 μg/g body weight dose of dsKIF11 in Procambarus clarkii at 12, 24, 36, 48, 60 and 72 h** indicates extremely significant difference (P<0.01).
图6  荧光显微镜下克氏原螯虾血淋巴细胞吞噬副溶血弧菌及荧光微球a. 副溶血弧菌;b. 荧光微球;c. 血淋巴细胞;d.副溶血弧菌与血淋巴细胞,白色方框指示位置为吞噬副溶血弧菌的血淋巴细胞;e. 荧光微球与血淋巴细胞,白色方框指示位置为吞噬荧光微球的血淋巴细胞;f. 副溶血弧菌、荧光微球与血淋巴细胞,白色方框指示位置为同时吞噬副溶血弧菌及荧光微球的血淋巴细胞. Fig. 6  Phagocytosis of Vibrio parahaemolyticus and fluorescent microspheres by Procambarus clarkii hemocytes observed under fluorescence microscopya. Vibrio parahaemolyticus; b. Fluorescent microspheres; c. Hemocytes; d. V. parahaemolyticus and hemocytes, the white box indicates phagocytosis of V. parahaemolyticus; e. Fluorescent microspheres and hemocytes, the white box indicates the phagocytosis of fluorescent microspheres; f. V. parahaemolyticus, fluorescent microspheres and hemocytes, the white box indicates phagocytosis of fluorescent microspheres and V. parahaemolyticus.
图7  克氏原螯虾KIFs基因敲降后血淋巴细胞对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)及荧光微球(fluorescent microspheres, Fm)的吞噬率*表示差异显著(P<0.05); **表示差异极显著(P<0.01). Fig. 7  Phagocytosis of Vibrio parahaemolyticus (Vp) and fluorescent microspheres (Fm) by hemocytes after KIFs gene knockdown in Procambarus clarkia* indicates significant difference (P<0.05); ** indicates extremely significant difference (P<0.01).
驱动蛋白基因调节克氏原螯虾血淋巴细胞的吞噬作用
杜国儒,解伟,左佳俊,刘伟,王雪惠,隋丽英,