2024, Vol. 31 
2. 中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东 广州 510380
3. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306
2. Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China
3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
斑鳢(Channa maculata)隶属于鲈形目(Perciformes)、鳢科(Channidae)、鳢属(Channa)，主要分布于珠江水系、闽江水系及广东、广西、湖南、海南和台湾等省区，是我国重要的淡水经济鱼类[1-2]。杂交鳢为乌鳢(Channa argus)和斑鳢的杂交F1，具有生长速度快、抗病能力强、易摄食人工配合饲料等优势，深受养殖户欢迎，已成为中国重要的淡水鱼养殖品种之一[3-4]。同时，斑鳢也是新品种“杭鳢1号”“乌斑杂交鳢”“雄鳢1号”的亲本来源。近年来，部分生产者为节省成本采用自繁自育的方式进行苗种生产，从而使亲鱼之间的亲缘关系也越来越近，引起了种质退化、生长速度差异大、抗逆性减弱、饵料系数增加等一系列问题[5]。因此在斑鳢遗传育种工作中，了解不同群体的遗传背景和亲缘关系，制订合理的育种方案，可有效提高育种效率和斑鳢亲本质量，对鳢的生产具有重要意义。
遗传多样性分析是评估遗传资源状况的重要手段[6]。单核苷酸多态性(SNP)作为第三代分子标记技术，已经成为遗传多样性分析和全基因组研究的标准方法之一[7]。高磊等[8]利用SNP标记分析了黄渤海沿岸的5个托氏琩螺(Umbonium thomasi)自然群体的遗传多样性和遗传分化特征。林璐等[9]通过筛选高质量SNP标记分析了海湾扇贝南部亚种(Argopecten irradians concentricus)的遗传多样性。刘凯等[10]在分析鲂鲌鱼类及其杂交子代的遗传结构研究中发现，SNP标记可以很好地区分三角鲂、翘嘴鲌、蒙古鲌及其杂交子代，并可以达到遗传结构分析的目的。周志雄等[11]在10种东方鲀(Takifugu)中共找到了595个种间特异性SNP位点，并发现东方鲀在野生环境下存在广泛的自然杂交现象，且属内系统发育关系较为复杂。刘东亚等[12]利用SNP芯片分型信息估计了低温波动条件下凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼虾体重性状的遗传参数。特定位点扩增片段测序技术(specific-locus amplified fragment sequencing, SLAF-seq)是一种新的简化基因组测序技术，通过限制性内切酶将基因组DNA进行酶切，筛选特定片段进行测序，可获得物种全基因组水平的SNP标记[13]。该测序技术具有成本低、效率高、可避免大量重复序列等优势，在畜禽[14]及农作物[15]中的研究应用比较广泛，近年来在水生生物中也有所应用。金方彭等[16]利用SLAF-seq在澜沧裂腹鱼(Schizothorax lantsangensis) 4个群体中共检测到736515个SNP位点，并分析了澜沧江中上游4个野生群体的遗传多样性；刘亚楠等[17]在14个克氏原螯虾(Procambarus clarkii)养殖群体遗传多样性研究中鉴定出了741147个SNP位点，实现了以较低成本对养殖群体遗传多样性的检测。
目前，SLAF-seq已广泛应用于高密度遗传图谱的构建、SNP位点的开发、群体遗传分析和QTL定位等研究[18-20]。上官清等[1]利用SSR分析了斑鳢野生群体的遗传结构。然而，通过SLAF-seq技术可获得全基因组范围的SNP，能够更全面地反映遗传变异信息。本研究利用SLAF-seq技术，对广东阳春等地7个野生斑鳢群体的118个样本进行全基因组变异检测，筛选多态性SNP标记，并进行群体遗传多样性分析和群体结构分析，探讨不同地区斑鳢种质资源的遗传背景及亲缘关系，为斑鳢种质资源的合理利用提供重要的参考依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料2017年4月至2018年9月采集来自广东、广西、福建、湖南、台湾5省7个斑鳢自然分布地区的118尾活体样本，取部分尾鳍置于含有无水乙醇的离心管中，做好标记，带回实验室后存于−20 ℃冰箱备用。样本采集信息见表1，采样点分布见图1。
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表1 斑鳢样本采集信息 Tab. 1 Information on the collection of Channa maculata samples |
07-0829-10-F001.jpg "点击查看原图") |
图1 斑鳢采样点分布示意图 Fig. 1 Distribution of sampling sites for Channa maculata |
参照试剂盒(美国Omega Bio-Tek公司) NO. D3096-02说明书提取基因组DNA。经1%琼脂糖凝胶电泳对DNA进行检测，检测合格后于−20 ℃冰箱保存备用。
1.3 酶切方案设计根据Sun等[13]方法构建斑鳢SLAF-seq文库，选取斑鳢(Channa maculata)基因组作为参考基因组进行电子酶切预测，斑鳢实际基因组大小为618.82 Mb, GC含量为39.75% (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_020496755.1/)。按照酶切片段在基因组上尽量分布均匀，位于重复序列酶切片段的比例低，酶切片段数量满足实验预期等原则确定酶切方案。
选定最适酶切方案后，对检测合格的各样本基因组DNA分别进行酶切。对得到的酶切片段(SLAF标签)进行3′端加A处理、连接Dual-index[21]测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用Illumina测序平台进行测序，获得测序reads。SLAF文库的构建及测序由北京百迈克生物科技有限公司完成。
1.4 SLAF标签和SNP标记的检测对斑鳢参考基因组进行电子酶切预测后，根据酶切方案选择原则，确定限制性内切酶组合为Rsa I+Hae III，酶切片段长度在364~414 bp的序列定义为SLAF标签。将测序获得的测序reads根据序列相似性进行聚类。确定reads的SLAF标签的来源，并利用BWA 0.7.17[22]将得到的reads比对到参考基因组上，统计不同染色体上的SLAF标签和多态性SLAF标签。SNP的检测是以斑鳢基因组作为参考基因组，利用BWA 0.7.17[22]将测序reads比对到参考基因组上，并使用GATK 4.2.0.0[23]和samtools 1.7[24]两种方法进行变异检测，以两种方法得到的SNP交集作为最终可靠的SNP数据集。
1.5 群体遗传多样性分析和遗传结构分析基于SNP数据，利用PLINK 2.0[25]软件计算期望杂合度(He)、观测杂合度(Ho)、多态性信息含量(PIC)，利用VCFtools 0.1.16[26]软件计算遗传分化指数(Fst)和基因流(Nm)。使用vcf2phylip 2.0[27]软件基于邻接法构建进化树，将输出结果上传到iTOL (https://itol.embl.de/)在线工具绘制系统发育树。通过admixture 1.3.0[28]软件，分析斑鳢的群体结构，针对7个自然分布群体，预先设定亚群数目(K值)为1~10进行聚类，并对聚类结果进行交叉验证，根据交叉验证错误率的最小值确定最优分群数。通过GCTA 1.93.3[29]软件，进行主成分分析，得到样品的聚类情况。
2 结果与分析 2.1 酶切方案与建库评估斑鳢基因组电子酶切预测到101933个SLAF标签，插入片段大小为364~414 bp, SLAF标签在基因组上分布基本均匀，确定限制性内切酶切组合为Rsa I+Hae III。
2.2 测序数据统计与评估为确保分析质量，提高数据评估和分析的准确性，将测序reads去掉接头序列、酶切识别位点、低质量碱基，最终保留126 bp高质量碱基序列用于后续分析。测序结果显示单个样品测序深度为7.61~48.64 X，整体平均测序深度为20.19 X，测序数据符合实验预期要求。118个斑鳢样品共获得374.68 Mb reads数据，测序样本GC含量为39.3%~42.2%，平均GC含量为41.16%, GC含量小于40%的只有两个样品，其余均在40%~60%内；测序样本质量值Q30为92.2%~96.29%，均大于90%，平均Q30为95.31%说明碱基错误率较低，测序结果较好，质量较高(表2)。
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表2 斑鳢SLAF标签和SNP信息 Tab. 2 SLAF labels and SNP information of Channa maculata |
根据测序结果，在118个斑鳢样本中检测出508066个SLAF标签，其中有375486个多态性标签，将测序reads比对到斑鳢参考基因组上，共得到2502887个SNP。各个样品的SNP数目范围为493243~1066702，其中斑鳢样品JH01获得的SNP数目最大，为1066702，斑鳢样品JH12获得的SNP数目最小，为493243。各样品检测到的SNP完整度变化范围为19.71%~42.62%, SNP杂合率为0.68%~16.68%。
2.4 群体结构分析基于获得的SNP数据，通过Admixture 1.3.0 软件分析斑鳢群体的遗传结构(图2)。亚群数目(K值)设为1~10，并对聚类结果进行交叉验证，K=6时交叉验证错误率(0.37487)最低。因此，可将118个样本分为6个亚群，其中江华群体与贺州群体被分为同一亚群，台北、邵武、阳春、化州、南宁5个地区的样本各自单独分为一个亚群。
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图2 7个斑鳢群体的遗传结构分析 Fig. 2 Genetic structure analysis of 7 Channa maculata populations |
由系统发育树(图3)可以看出，7个地区的斑鳢样本各自聚集到一起，形成明显的地理群体分支，遗传结构较为单一。其中贺州群体与江华群体的亲缘关系最接近，且聚为一个分支，与admixture分析结果基本一致。
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图3 7个斑鳢群体的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree of 7 Channa maculata populations |
为进一步明确群体间的亲缘关系，通过GCTA 1.93.3软件，对118个斑鳢样本进行主成分分析，得到样品的聚类情况(图4)。通过PCA分析，可以看出台北群体与其他6个群体间表现出明显的空间分离情况，各群体遗传结构单一。该结果与admixture和系统发育树的分析结果一致。
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图4 7个斑鳢群体的PCA分析 Fig. 4 PCA analysis of 7 Channa maculata populations |
7个斑鳢群体间基因流(Nm)和群体间遗传分化指数(Fst)计算结果如表3。群体间Nm为0.24118~0.62035，均小于1，群体间基因交流很少。群体间Fst为0.15300~0.78658，均大于0.15；台北与6个大陆群体间遗传分化指数均大于0.50000，遗传分化极大。
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表3 斑鳢群体间遗传分化指数和基因流 Tab. 3 Pairwise genetic differentiation and gene flow among populations of Channa maculata |
多态性信息含量和杂合度(heterozygosity, H)等参数是衡量物种遗传多样性高低的重要标准。为更准确地评估斑鳢群体的遗传多样性，通过计算Ho、He、PIC、最小等位基因频率(MAF)、根井正利基因多样性指数和香农-威纳指数来分析各群体的遗传变异程度，统计结果如表4。7个斑鳢群体Ho为0.2145~0.3393, He为0.3304~0.3580, PIC为0.2672~0.2872, MAF为0.2416~0.2652，根井正利基因多样性指数为0.3414~0.3710，香农-威纳多样性指数为0.5019~0.5360。7个群体Ho均低于He，台北Ho与He最接近，化州、贺州群体的Ho与He差异较大。群体间PIC值、根井正利基因多样性指数和香农-威纳多样性指数差异较小，整体的遗传多样性水平都不高，处于中度多态性水平。
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表4 斑鳢群体遗传多样性指数 Tab. 4 Populations of Channa maculata genetic diversity index |
种质资源评价是遗传育种工作的基石，解析不同群体遗传多样性、亚群划分与亲缘关系，对提高育种效率至关重要[30]。现阶段斑鳢苗种场以作坊型散户为主，缺乏大型种业企业，群体近交现象难以避免，造成了群体遗传多样性逐渐降低等危害[31]。目前，水生生物的群体遗传多样性分析和群体结构分析大部分都是通过第二代分子标记技术SSR和线粒体DNA标记进行的。SSR数量标记有限，无法代表全基因组水平[32]，而线粒体DNA只能反映母系的遗传信息，无法反映父系的遗传信息[33]。本研究采用了SLAF-seq技术，基于SNP标记分析了7个野生斑鳢群体的遗传结构和遗传多样性，更加全面地评估了不同群体间的亲缘关系，为斑鳢种质资源的合理利用提供了科学依据。
3.1 斑鳢群体的遗传结构本研究基于SNP位点对118个斑鳢样本进行了群体遗传结构分析。系统发育树可以看出，江华群体与贺州群体亲缘关系最近，且湖南江华与广西贺州地理位置也很接近。Structure分析结果显示，江华群体与贺州群体被分为同一亚群。因此，可将江华群体与贺州群体视为一个单元进行管理。其他地区斑鳢群体各自聚成一簇，每个地区表现出一致的遗传背景，没有发现基因交流迹象。本研究中7个斑鳢群体，遗传结构较为单一，推测是因为斑鳢具有护幼习性，属于非洄游性鱼类，各个群体间地理位置相隔较远，在没有人为干扰或者是巨大的环境变化下，很难出现群体间的基因交流。在乌鳢[34]、宽额鳢(Channa gachua)[35]等具有相似生活习性的鳢科鱼类群体研究中发现，不同地区的群体形成了相对独立的遗传群体，地域分化明显。杨喜书等[36]对攀鲈(Anabas testudineus)群体进行遗传多样性分析时发现，澜沧江与华南6水系(九龙江、韩江、珠江、鉴江、南渡江、万泉河)群体间均表现出强烈的遗传分化情况；同时在河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)[37]的4个地理群体(太湖、望江、当涂、休宁)遗传多样性和遗传结构研究中发现，群体间极少有基因交流现象，群体结构单一，与本研究结果相似。然而，在青鱼(Mylopharyngodon piceus)的9个群体的遗传变异分析中发现，群体间的遗传分化主要处于低度和中度分化水平，有一定的基因交流迹象，是因为青鱼的溯河产卵洄游性，使得各个群体之间产生了一定的基因交流[38]。
群体间的遗传分化程度可以用遗传分化指数(Fst)来表示，Fst值越大，群体间的遗传分化程度就越高[39]。台北群体与其他群体间的Fst均大于0.50000，群体间有极大的遗传分化。在PCA分析中，台北群体显示出了明显的空间分离，推测是台湾海峡隔离阻断了台北群体与大陆群体间的基因交流。对短棘鲾(Leiognathus equulus)和大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)的研究也证实了台湾海峡隔离对部分鱼类群体间遗传分化程度的影响。高天翔等[40]在短棘鲾群体的遗传学研究中发现，台湾新竹群体与海南文昌、三亚新村群体之间的Fst存在显著差异，而海南文昌群体和三亚新村群体之间却无显著性差异；施文瑞等[41]研究发现，大鳞副泥鳅台湾群体与辽宁、河南、湖北3个群体间的遗传分化程度极大，且遗传距离较为遥远。基因流(Nm)描述了遗传物质在不同群体之间的迁移和交换情况，群体间基因流水平的高低反映了其遗传分化程度的大小，Nm越大，则认为群体间的基因交流越频繁[42-43]。本研究中群体间Nm均小于1，群体间最大Nm也只有0.62035，各群体间相对孤立，没有发现基因交流迹象，与Fst分析结果一致。周伟等[34]对8个乌鳢群体的遗传结构分析中发现，除河南洛阳(LY)与陕西渭南(WN)、江苏射阳河(SYR)与陕西渭南(WN)、江苏射阳河(SYR)与山东德州(DZ)群体间存在较小的遗传差异外，大多数群体之间表现出较大的遗传分化，这与本研究中斑鳢群体遗传分化程度基本相似。
3.2 斑鳢群体的遗传多样性杂合度指的是某一基因座上的等位基因是杂合体的频率，通常用来评估群体的遗传多样性。台北群体观测杂合度与期望杂合度值非常接近，说明台北群体处于遗传平衡状态，具有较高的纯化度；其他群体观测杂合度与期望杂合度均有一定差异，表明阳春、化州、南宁、贺州、江华、邵武6地斑鳢群体处于遗传不平衡状态，可能是群体内存在不同程度的近交现象；贺州、化州两个群体观测杂合度均低于期望杂合度，且有较大差距，估计是频繁近交导致的。在6个野生与选育鲤(Cyprinus carpio)群体的遗传分析[44]和3个大口黑鲈(Micropterus salmoides)群体的遗传分析[45]中均发现各个群体的Ho与He存在一定差异。
PIC反映了基因位点在群体中的多态性情况，是衡量群体遗传多样性的重要指标[46]。根井正利基因多样性指数和香农-威纳多样性指数也可以反映群体的遗传多样性水平，其数值越大，说明基因丰富度就越高[16]。本研究中7个斑鳢群体PIC均大于0.2500，且各群体间差异较小，属于中度多态性水平。而上官清等[1]利用SSR对广州等6个自然分布斑鳢群体的遗传多样性分析中发现，群体的PIC均大于0.5000，与本研究结果有所差异。由于分子标记方法的不同，得到的遗传多样性参数值也会不同。微卫星通常由多个重复单元组成，变异性高，因此多态性也较高，而SNP是单个核苷酸的变异，通常只有两个等位基因，计算的PIC值相对较低。在罗慧等[47]对青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)遗传多样性研究中也证实了不同分子标记获得的苷酸多样性指数无法直接比较的情况。李光华等[48]利用SLAF-seq技术分析了短须裂腹鱼(Schizothorax wangchiachii)群体的遗传多样性，PIC为0.2562；金方彭等[49]利用SLAF-seq技术对4个光唇裂腹鱼(Schizothorax lissolabiatus Tsao)群体进行了遗传多样性分析，其根井正利基因多样性指数为0.2868~0.3248，香农-威纳多样性指数为0.4269~0.4810, PIC为0.2237~0.2553，与本研究结果相似。
4 结论本研究中7个斑鳢群体遗传多样性处于中等水平，遗传结构单一。各群体间无基因交流迹象，台北群体与其他6个群体间遗传分化程度极大。化州群体和江华群体内可能存在频繁的近交现象，在后续的遗传育种工作中应结合不同群体的遗传多样性分析，采取合适的繁殖策略。本研究为实现各地区斑鳢野生资源的保护与可持续利用提供了重要的参考依据，在育种工作中需特别注重种质资源的亲缘关系，促进斑鳢种质资源的合理利用，加速品种改良和种质创新。
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