2024, Vol. 31 
2. 上海海洋大学水产与生命学院，水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306
2. College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University; Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai 201306, China
盐碱水一般指矿化度为1000~50000 mg/L的一种特殊的水体，不同于海水和淡水，具有较高的碳酸盐碱度，其离子成分复杂、类型多样，由于人畜无法饮用，农业无法直接利用，绝大多数处于闲置状态[1]。我国是盐碱水资源大国，现有约6.9亿亩的低洼盐碱水域[2]，随着可利用的内陆水资源不断减少，如何开发利用长期闲置的盐碱水域资源无疑成为拓展水产养殖空间有效措施。天然水域中的总碱度主要由${\rm{CO}}_3^{2 - }$和${\rm{HCO}}_3^ - $构成，因此碳酸盐碱度是衡量水体碱度的一个重要指标[3]。周凯等[4]、么宗利等[5]、柳飞等[6]发现高碳酸盐碱度抑制水产动物生长存活和繁殖代谢，而驯养耐受高碳酸盐碱度的水产动物无疑是高效利用盐碱水养殖模式研究热点[7]。2020年农业农村部实施水产绿色健康养殖“五大行动”中明确提出，因地制宜示范推广盐碱地水产养殖模式，为盐碱水渔业产业的发展提供了政策依据[8]。因此，探讨水产动物盐碱胁迫生理响应机制对于开发利用盐碱水渔业资源具有重要意义。
近年来，关于盐碱水养殖经济水产动物的研究已有大量报道，如尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)[9]、方正银鲫(Carassius auratus)[10]、青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)[11]、瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)[12]、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[13]、日本沼虾(Macrobrachium nipponense)[14]、拟穴青蟹(Scylla paramamosa)[15]等，但关于罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)盐碱胁迫生理响应研究尚未见详细报道。罗氏沼虾是经济价值较高的淡水虾类之一，其幼体阶段在海水中度过，可耐受一定范围的盐碱度[16]，由此罗氏沼虾作为盐碱水域养殖的经济虾类已有研究报道[17-19]。肠道是虾类消化和吸收营养物质的主要场所，肠道健康是保障虾类正常生长繁育的重要因素[20-21]，但迄今为止，针对碳酸盐碱度胁迫对虾类肠道健康的影响研究较为匮乏。
本研究首先分析不同浓度碳酸盐碱度对罗氏沼虾幼虾的毒性作用，并以此确定幼虾的碳酸盐碱度半致死浓度，随后观察碳酸盐碱度慢性胁迫下罗氏沼虾的生长与繁殖情况，辅以肠道微绒毛结构、围食膜结构和肠道菌群结构变化数据，从而了解碳酸盐碱度慢性胁迫对罗氏沼虾生长和肠道健康的影响，旨为碳酸盐型盐碱水域养殖罗氏沼虾提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用罗氏沼虾幼虾采购于海南汇鑫苗种有限公司，挑选规格一致、健康活泼的幼虾作为实验虾，平均体重(2.85±0.12) g，正式实验前先在室内控温循环水养殖玻璃缸(80 cm×60 cm×50 cm)暂养14 d。暂养期间每天按照幼虾体重3%~5%投饲率进行投喂，具体根据摄食情况调整投喂量，每天投喂商业配合饲料(蛋白质含量≈40%) 2次(7:30和18:30)，并在投食1 h后吸出残余饵料，同时在养殖系统内放置隐蔽物，以降低罗氏沼虾间自残机率。实验用水为过滤曝气自来水，每个饲养单元配有独立增氧设备，暂养期间保持水体溶解氧(6.3±0.2) mg/L，水体温度(27±1) ℃，水体pH7.6~7.8，碳酸盐碱度为1.5 mmol/L，水体氨氮浓度<0.3 mg/L，水体亚硝酸盐浓度<0.02 mg/L。
1.2 急性胁迫实验虾类养殖池塘碳酸盐碱度的均值在1.94~3.32 mmol/L之间，而西北内陆型盐碱水域极值范围为1.7~20.0 mmol/L[3]，故本研究用水为过滤自来水加入相应量的Na2CO3、NaHCO3进行碳酸盐碱度调节，用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L NaOH微调，稳定24 h后用于实验。本研究设置碳酸盐碱度梯度为1.5、5、10、15、20和30 mmol/L，采用酸碱滴定法监测实验水体碳酸盐碱度，通过配置相应碱度的更换水体来保持碳酸盐碱度稳定，各实验组中的碳酸盐碱度实测值为(1.52±0.04) mmol/L、(5.05±0.06) mmol/L、(10.45±0.11) mmol/L、(15.78± 0.15) mmol/L、(20.95±0.22) mmol/L和(31.06± 0.28) mmol/L。每个碳酸盐碱度梯度设置3个重复，每个重复在玻璃缸中放置10尾虾，实验周期幼虾不摄食饲料。实验过程中定时观察幼虾的活动情况，幼虾沉底后仅剩游泳足微摆的个体被视为昏迷，对刺激无明显反应的个体则被视为死亡[22]，分别在12 h、24 h、48 h和96 h记录各组死亡个体数，死亡后的个体及时捞出。相关计算公式如下：
| $半致死浓度\left( {{\rm{L}}{{\rm{C}}_{{\rm{50}}}}} \right){\rm{ = }}{\lg ^{ - {\rm{1}}}}\left[ {{X_m} - i\left( {\sum p - {\rm{0}}.{\rm{5}}} \right)} \right]$ |
式中，Xm为最大剂量的对数值；i为相邻两组对数剂量的差值；p为各组罗氏沼虾的死亡率；
| $安全浓度\left( {{\rm{SC}}} \right) = \frac{{48\;{\rm{h}}\;{\rm{L}}{{\rm{C}}_{50}} \times 0.3}}{{{{\left( {24\;{\rm{h}}\;{\rm{L}}{{\rm{C}}_{50}} \div 48\;{\rm{h}}\;{\rm{L}}{{\rm{C}}_{50}}} \right)}^2}}}$ |
在确定罗氏沼虾幼虾碳酸盐碱度半致死浓度的基础上，依据半致死浓度设置碳酸盐碱度慢性胁迫实验浓度梯度，共设置1.5、3、6和9 mmol/L共4个实验组，分别命名为C1 (对照组)、C3、C6和C9组，碳酸盐碱度调节方法同
| $成活率\left( {{\rm{SR, \% }}} \right) = \frac{{实验末虾尾数}}{{实验初虾尾数}} \times 100\% $ |
| $增重率({\rm{WGR, \% }}) = \frac{{终末体重 - 初始体重}}{{初始体重}} \times 100\% $ |
| $\begin{array}{l} 特定生长率\left( {{\rm{SGR, \% /d}}} \right) = \\ \;\;\;\;\frac{{\ln \left( {终末体重} \right) - \ln \left( {初始体重} \right)}}{{实验天数}} \times 100\% \end{array}$ |
| $饲料系数\left( {{\rm{FCR}}} \right) = \frac{{总耗料量}}{{终末体重 - {\rm{初始体重}}}}$ |
选择性成熟的雄虾，选择标准为其雄性第二步足大大超过身体的长度；选择卵巢发育至Ⅱ期的雌虾，选择标准为在头胸甲处可以观察到亮黄色卵巢[23]。分别设置1.5、3、6和9 mmol/L共4个碳酸盐碱度实验组，每个重复组放置10尾雌虾和5尾雄虾，随机放入12个配有增氧设备的玻璃缸内，每组设置3重复。实验周期为35 d，期间抱卵虾要单独饲养于相应碳酸盐碱度梯度的水体中。实验结束后，分别统计卵巢发育成熟的雌虾数量及抱卵溞虾的数量、亲虾抱卵数量、幼体孵出数量。绝对抱卵量通过解剖相同体长或体重的抱卵虾计算抱卵量来进行推算[6]，按以下公式计算：
| $孵化率 = \frac{{孵出幼体总量}}{{抱卵总量}}$ |
幼虾养殖实验结束后，每组重复随机取3尾虾的肠道置于4%多聚甲醛固定，用于肠道组织形态学观察。每个重复随机另取3尾虾，置于冰面上，酒精棉球擦拭体表进行消毒，活体解剖，取完整肠道去除周围的脂肪和残留的食糜，用预冷的灭菌生理盐水冲洗数次后立即放入2 mL冻存管中液氮速冻，再转移到–80 ℃冰箱中保存用于肠道菌群结构分析。
1.4.1 肠道组织形态学观察取新鲜肠道组织样品，生理盐水冲洗后用10%中性缓冲福尔马林固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，处理好的组织按常规石蜡包埋组织的制备流程进行制备，制成4 μm的石蜡切片[24]。对石蜡切片分别进行染色。(1) 过碘酸雪夫染色(periodic Acid-Schiff stain, PAS)，具体方法为：将切片脱蜡、脱水，经过碘酸氧化和Schiff氏液避光染色，使用苏木精染细胞核，切片再经脱水、透明、封固后在光学显微镜下观察，细胞核蓝染，而含糖类物质(几丁质等)则呈紫红色；(2) 钙荧光白荧光染色(calcofluor white; CFW)，具体方法为，将切片脱蜡、脱水，使用钙荧光白荧光染色液(Sigma-Aldrich)染色，孵育5 min后，切片再经脱水、透明、封固，使用荧光显微镜观察，激发波长355 nm，散发波长440 nm。几丁质显示强烈蓝色荧光。
1.4.2 透射电镜样品制备分析选取C1、C3、C6和C9组罗氏沼虾幼虾各2只，活体解剖取出肠道，组织大小1~2 mm3，置于1.5 mL离心管中于2.5%的戊二醛溶液固定。磷酸缓冲液漂洗3次后，1%的锇酸溶液固定样品2 h，酒精梯度脱水，纯丙酮处理20 min, Epon 812树脂包埋。组织样品在LEICA EM UC7型超薄切片机中以厚度为70~90 nm进行切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色5~10 min，透射电镜(JEM-1400Flash)观察拍照。
1.4.3 扫描电镜样品制备分析选取对照组和C9组的罗氏沼虾幼虾各2只，活体解剖取出完整肠道，在体视显微镜(SMZ-201)下将肠道纵向切开，观察到管腔表面和包裹食物颗粒的完整围食膜，全部小心置于1.5 mL离心管中于2.5%的戊二醛溶液固定。固定后，组织在梯度乙醇中脱水，并用醋酸异戊酯代替。然后对样品进行临界点干燥、裱片、溅射、镀金，并用扫描电镜(JSM-840)进行观察。
1.4.4 肠道菌群结构测定以引物序列338F (5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′- GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)进行各样本肠道菌群总DNA上16S rDNA的V3-V4高变区的PCR扩增[25]。PCR扩增体系20 μL: 5×Fast Pƒ buffer 15 μL，上下游引物(5 μmol/L)各0.2 μL, BSA 0.2 μL, Model模板DNA 2 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL; FastPfu DNA Polymerase 0.4 μL; ddH2O补足体系。PCR反应条件：94 ℃高温变性5 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 40个循环；4 ℃保持。PCR结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测每个样本的PCR产物。扩增后的样本在Illumina-Mi Seq平台上完成高通量测序。
1.5 生物信息学分析对测序获得的双端序列数据进行质控处理。根据PE reads之间的Overlap关系，利用FLASH(v1.2.7)将每个样品的reads拼接成原始Tags数据。采用Trimmomatic (v0.33)软件，对原始Tags数据进行过滤得到优质序列。通过UCHIME (v4.2)比对去除序列的嵌合体以获得有效序列。基于QIIME (v18.0)软件，利用UCLUST对序列相似度≥97%的全部tags进行聚类形成OTUs (operational taxonomic units)，所有数据均在数据库Silva (https://www. arb-silva.de/)中对其进行分类学注释，绘制不同生物分类水平上的肠道菌群相对丰度和组成结构[26]。利用Mother (v.1.30)软件基于OTUS进行Alpha多样性分析，包括Observed-OTUs、Chaol、Shannon和Simpson等指数，使用QIIME软件进行Beta多样性分析，主要采用weighted_ unifrac和unweighted_unifrac算法进行NMDS分析来对比样本间的差异。最后，使用PICRUSt软件预测罗氏沼虾各样本间肠道菌群功能[27]。
1.6 数据统计与分析实验数据以3个重复样本数据的平均值±标准误差($\bar{x}\pm \text{SE}$)表示。采用SPSS 26.0对数据进行统计分析，先对数据进行单因素方差分析(one- way ANOVA)，再用Duncan氏法进行多重比较。显著性水平设为0.05。
2 结果与分析 2.1 急性碳酸盐碱度对罗氏沼虾幼虾的毒性作用随着碳酸盐碱度浓度的升高，罗氏沼虾幼虾死亡率也相应增加(表1)。与对照组相比，低浓度碳酸盐实验组中，幼虾能够正常存活；高浓度碳酸盐碱度实验组中，幼虾游泳速度显著下降，短时间内开始出现死亡现象，在碱度30实验组中更为严重。若对照组中出现死亡现象，可根据公式p=(p'−c)/(1−c)计算各组校正后的死亡百分数，其中，p为校正后的死亡百分数，p′为实验组观察所得死亡百分数，c为对照组的死亡百分数[35]。通过碱度对罗氏沼虾幼虾毒性的分析可知，幼虾在12、24、48和96 h的LC50碱度分别为28.69、24.15、21.52和17.86 mmol/L，安全浓度为5.118 mmol/L。
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表1 罗氏沼虾幼虾不同碱度下的死亡率、半致死碱度及安全浓度 Tab. 1 Mortality, half lethal alkalinity and safe concentration of juvenile Macrobrachium rosenbergii under different concentration of carbonate alkalinity n=3; $\bar{x}\pm \text{SE}$ |
不同碳酸盐碱度胁迫下，罗氏沼虾幼虾的生长性能如表2所示。与对照组相比，各实验组间幼虾增重率、特定生长率和成活率均随碳酸盐碱度浓度的升高而降低。与对照组相比，C3组碳酸盐碱度对幼虾生长性能未造成显著影响(P>0.05); C6和C9组实验幼虾增重率、特定生长率和成活率呈显著下降(P<0.05)，均在C9组显著低于其他实验组(P<0.05)。饲料系数随碳酸盐碱度浓度的上升而升高，在C9组显著高于其他实验组(P<0.05)。
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表2 碳酸盐碱度对罗氏沼虾幼虾生长性能的影响 Tab. 2 Effects of carbonate alkalinity on the growth performance of juvenile Macrobrachium rosenbergii n=3; $\bar{x}\pm \text{SE}$ |
碳酸盐碱度胁迫对罗氏沼虾抱卵率和孵化率影响如表3所示，各实验组间雌虾均能抱卵，且抱卵率和孵化率均随碳酸盐碱度浓度的升高而降低。与对照组相比，C3组碳酸盐碱度对罗氏沼虾的繁殖性能影响不显著(P>0.05); C6组雌虾抱卵率和孵化率均显著低于对照组和C3组(P<0.05), C9组雌虾抱卵率和孵化率则显著低于其他3组实验组(P<0.05)。
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表3 碳酸盐碱度对罗氏沼虾幼虾抱卵率和孵化率的影响 Tab. 3 Effects of carbonate alkalinity on the spawning rate and egg incubation rate of juvenile Macrobrachium rosenbergii n=3; $\bar{x}\pm \text{SE}$ |
在不同碳酸盐碱度慢性胁迫下罗氏沼虾肠道微绒毛变化情况如图1所示。透射电镜结果显示，对照组罗氏沼虾幼虾肠道细胞结构较为完整，肠道微绒毛排列紧密而有序(图1a)。随碳酸盐碱度浓度升高，罗氏沼虾幼虾肠道微绒毛脱落程度加剧，且有逐渐变为椭圆形的趋势(图1b~1d)。与对照组相比，高碳酸盐碱度C9组中幼虾肠道微绒毛结构排列紊乱(图1d)。
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图1 罗氏沼虾幼虾肠道微绒毛透射电镜图a. 对照组；b. 碳酸盐碱度3 mmol/L组；c. 碳酸盐碱度6 mmol/L组；d. 碳酸盐碱度9 mmol/L组. MV：微绒毛. Fig. 1 Representative transmission electron microscopy images of the intestinal microvilli of juvenile Macrobrachium rosenbergiia. Control group; b. Carbonate alkalinity 3 mmol/L; c. Carbonate alkalinity 6 mmol/L; d. Carbonate alkalinity 9 mmol/L. MV: microvilli. |
PAS染色结果显示，对照组幼虾肠腔中充满食物残渣，食物残渣外部包裹一层致密的紫红色的围食膜，肠腔高度扩张，上皮层完整，排列有序(图2a); C3组肠腔中出现少量的脱落的上皮细胞(图2b); C6组肠腔中出现大量的脱落的上皮细胞，围食膜破碎(图2c); C9组肠腔中出现成片脱落的上皮细胞，围食膜结构破损严重，上皮细胞变得十分扁平，细胞排列凌乱(图2d)。
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图2 罗氏沼虾幼虾肠道组织PAS染色图a. 对照组；b. 碳酸盐碱度3 mmol/L; c. 碳酸盐碱度6 mmol/L; d. 碳酸盐碱度9 mmol/L. 黑色箭头为围食膜；白色箭头为脱落的上皮细胞. Fig. 2 PAS staining histology of intestinal tissues of juvenile Macrobrachium rosenbergiia. Control group; b. Carbonate alkalinity 3 mmol/L; c. Carbonate alkalinity 6 mmol/L; d. Carbonate alkalinity 9 mmol/L. The black arrowheads are peritrophic matrices; the white arrowheads are the shed epithelial cells. |
进一步利用CFW染色观察其围食膜结构，结果显示，对照组幼虾肠腔中围食膜结构完整，荧光信号强，致密，并紧密包裹食物残渣(图3a); C3组肠腔中围食膜结构较完整，荧光信号强，致密，并紧密包裹着内容物(图3b); C6组肠腔中围食膜出现破损，呈散块状包覆在内容物上，荧光信号弱，表明其质地脆弱(图3c); C9组肠腔中围食膜呈游离团块状，荧光信号大幅降低，表明围食膜结构已严重受损(图3d)。说明碳酸盐碱度胁迫对罗氏沼虾肠道围食膜造成一定程度损伤。
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图3 罗氏沼虾幼虾肠道组织钙荧光白荧光染色(CFW)染色图a. 对照组；b. 碳酸盐碱度3 mmol/L; c. 碳酸盐碱度6 mmol/L; d. 碳酸盐碱度9 mmol/L. 白色箭头指示围食膜. Fig. 3 Calcofluor white (CFW) staining histology of intestinal tissues of juvenile Macrobrachium rosenbergiia. Control group; b. Carbonate alkalinity 3 mmol/L; c. Carbonate alkalinity 6 mmol/L; d. Carbonate alkalinity 9 mmol/L. The white arrowheads point to peritrophic matrices. |
根据PAS和CFW染色的结果，挑选围食膜结构影响水平最大的C9组与对照组进行扫描电镜分析，如图4所示。碳酸盐碱胁迫下罗氏沼虾肠道围食膜出现明显形变。在×5000倍数下，对照组肠道围食膜表面光滑、有光泽，整体较为平整(图4a), C9组肠道围食膜表面较为粗糙、暗淡，整体呈波浪形，存在多个皱褶(图4d)；在×10000倍数下，对照组肠道围食膜表面光滑致密(图4b), C9组肠道围食膜表面粗糙，结构松散(图4e); ×100000倍数下，对照组肠道围食膜结构紧密，几丁质层平整、光滑，围食膜孔隙较小(图4c); C9组肠道围食膜结构松散，几丁质层表面粗糙，围食膜孔隙较大(图4f)。
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图4 罗氏沼虾幼虾肠道围食膜扫描电镜图a. ×5000倍数下对照组；b. ×10000倍数下对照组；c. ×100000倍数下对照组；d. ×5000倍数下C9组(碳酸盐碱度9 mmol/L); e. ×10000倍数下C9组；f. ×100000倍数下C9组. 白色箭头为围食膜孔隙. Fig. 4 Representative scanning electron microscope images of the intestinal peritrophic matrix of juvenile Macrobrachium rosenbergiia. Control group at ×5000 times; b. Control group at ×10000 times; c. Control group at ×100000 times; d. Group C9 (carbonate alkalinity 9 mmol/L) at ×5000 times; e. Group C9 at ×10000 times; f. Group C9 at ×100000 times. The white arrowheads are peritrophic matrix pores. |
在0.97的相似度下，各实验组幼虾肠道样品通过高通量测序和数据分析共获得3131个OTUs (448654个reads)。韦恩图呈现了每个样本的OTU数量，其中C1、C3、C6和C9组样品中检出的OTU数依次为1310、1174、1140、1322个，共有的OTU数为512个(图5)，从韦恩图数据可知共有的OTU的比例接近一半，说明尽管投喂相同配合饲料，其在不同碳酸盐碱度环境下罗氏沼虾幼虾肠道细菌群落仍具有一定相似性。此外，Alpha多样性分析结果显示(表4), C9组肠道样品中的菌群丰富度指数Chao1与对照组无显著差异(P>0.05)，但是显著高于C3和C6实验组(P<0.05)；肠道菌群多样性指数Shannon和Simpson在各实验组间差异不显著(P>0.05)。
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图5 碳酸盐碱度胁迫下罗氏沼虾肠道菌群Venn图 Fig. 5 Venn diagram of intestinal microbiota in Macrobrachium rosenbergii with carbonate alkalinity |
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表4 碳酸盐碱度慢性胁迫对罗氏沼虾幼虾肠道菌群Alpha多样性指数的影响 Tab. 4 Effect of carbonate alkalinity on the Alpha diversity index of intestinal microbiota in Macrobrachium rosenbergii n=3; $\bar{x}\pm \text{SE}$ |
基于Weighted_Unifrac距离对所有肠道样品菌群组成进行NMDS分析后发现，与对照组相比，各实验组的肠道样品之间距离较大，大部分散于不同象限，而组内差异较小，大都聚集在一起，说明不同实验组的肠道样品间菌群结构相似性较小(图6)。
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图6 基于NMDS分析的加权UniFrac分析 Fig. 6 NMDS analysis chart by weighted UniFrac |
基于层次聚类树分析结果显示，4组样品被分为3大类，其中对照组和C9组各自单独聚为一类，C3和C6组聚为一类，这说明与对照组样品相比，C3和C6组样品中菌群结构的相似度更为接近(图7)。在门的水平上，共鉴定出33个细菌门类，12个样品中均有分布且为优势菌门(平均相对丰度>1%)的是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)，这6类优势菌群占肠道菌群的比例超过90%。如图7所示，随碳酸盐碱度升高，C9组样品中菌门组成丰度与对照组相比出现明显变化，其中拟杆菌门物种丰度明显升高。进一步对罗氏沼虾肠道菌群在属的水平上进行深度分析结果如表5所示。与对照组相比，在高碳酸碱度胁迫下，C9组幼虾肠道条件致病菌黄杆菌属(Flavobacterium)和假单胞菌属(Pseudomonas)物种丰度显著高于其他实验组(P<0.05)。
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图7 门水平上各碳酸盐碱度胁迫组罗氏沼虾肠道菌群水平聚类分析 Fig. 7 Cluster analysis of intestinal microbiota from Macrobrachium rosembergii exposed to different carbonate alkalinity at the level of phylum |
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表5 碳酸盐碱度慢性胁迫对罗氏沼虾幼虾肠道不同菌群属水平相对丰度差异的影响 Tab. 5 Effect of carbonate alkalinity on the relative community abundance on genus levels of different intestinal microbiota in Macrobrachium rosenbergii n=3; $\bar{x}\pm \text{SE}$ |
本研究发现罗氏沼虾幼虾96 h的碳酸盐碱度LC50值为17.86 mmol/L，这与王桂春等[28]在罗氏沼虾仔虾中得出的碳酸盐碱度LC50值相接近。本研究发现高碳酸盐碱度水体会腐蚀虾的鳃组织，造成虾呼吸障碍，与王慧等[29]研究结果相类似。高碳酸盐碱度条件下Ca2+也会以沉淀析出，较低的Ca2+浓度会进一步影响虾的蜕皮及其他正常生理活动[30]，这是高碳酸盐碱度胁迫影响虾类存活的原因之一。罗氏沼虾碳酸盐碱度半致死浓度普遍高于其他经济虾类，譬如中国对虾(Denaeus chinensis) 96 h碳酸盐碱度LC50值为6.18 mmol/L[31-32]，脊尾白虾96 h碳酸盐碱度LC50值为8.73 mmol/L[6]，而凡纳滨对虾幼虾96 h LC50值为10.49 mmol/L[33]，由此可知，罗氏沼虾对碳酸盐碱度胁迫具有较强的适应能力，适宜在盐碱水中养殖。
3.2 慢性碳酸盐碱度胁迫对罗氏沼虾幼虾生长性能和肠道组织结构的影响增重率、特定生长率和成活率是衡量水产动物生长和养殖效益的重要指标，也是判断盐碱水养殖罗氏沼虾生长性能的主要手段[34]。杨富亿等[35]、赵丽慧等[36]研究发现碳酸盐碱胁迫会抑制鱼虾的生长，这与本研究结果相吻合，产生这一现象的原因可能是高碳酸盐碱度胁迫会对鳃和肠道的组织结构产生损害，影响机体呼吸代谢和消化吸收能力，并导致其生长速率减慢[37-38]，鉴于罗氏沼虾拥有较为低等的开放式循环系统，血淋巴中的酸碱平衡变化会影响到其他组织，如肠道等[39]，本研究进一步通过透射电镜分析，观察到碳酸盐碱度慢性胁迫下罗氏沼虾肠道微绒毛的脱落，且脱落程度与碳酸盐碱度浓度呈正相关，证实高碳酸盐碱度慢性胁迫下肠道组织结构损伤是导致罗氏沼虾幼虾生长受到抑制的主要原因。
3.3 慢性碳酸盐碱度胁迫对罗氏沼虾幼虾抱卵率和孵化率的影响有关碳酸盐碱度对水生动物繁殖影响的关注报道较少，在本研究中，当水体碳酸盐碱度为3 mmol/L时，罗氏沼虾幼虾抱卵率和孵化率均不受碱度胁迫影响，抱卵罗氏沼虾的受精卵均可孵化，但在9 mmol/L碱度水体时，雌虾未能进行有效繁殖，这与在脊尾白虾中的研究结果相一致[6]，已有研究通过对碳酸盐碱胁迫下脊尾白虾眼柄和卵巢进行转录组分析，发现繁殖性能的下降与盐碱胁迫抑制神经内分泌激素有关[40]，这一现象背后的具体作用途径及其机制值得后续深入研究。
3.4 慢性碳酸盐碱度胁迫对罗氏沼虾幼虾肠道围食物膜结构的影响鉴于甲壳动物肠道微绒毛具有分泌围食膜的功能[41]，高碳酸盐碱度胁迫下罗氏沼虾幼虾肠道微绒毛结构损伤会导致其黏液层(围食膜)的屏障作用受到影响。围食膜是一种非细胞结构，由几丁质纤维和蛋白质组成，由中肠上皮细胞合成和分泌，它位于中肠上皮细胞内壁，是肠道与食物残渣之间的机械屏障，能够防止机体受到物理损伤和病原体入侵[42]。本研究中，随着碳酸盐碱度的升高，通过不同染色方式观察到罗氏沼虾肠道围食膜结构破碎，进一步采用扫描电镜观察到围食膜表面粗糙和孔隙增大。有研究指出肠道细菌可能利用自身的几丁质酶增大围食膜的渗透性和孔隙[43]，提示高碳酸盐碱度慢性胁迫下肠道围食膜结构受损可能与肠道菌群结构失调有关。
3.5 慢性碳酸盐碱度胁迫对罗氏沼虾幼虾肠道菌群结构的影响甲壳类动物肠道菌群的动态平衡在维持肠道健康方面发挥着至关重要的作用，稳定的肠道菌群结构有利于其营养吸收、免疫调节和抵御病原体[44-45]。在本研究中，罗氏沼虾肠道样品中的优势菌群均为变形菌门、拟杆菌门与厚壁菌门等，这与先前虾类研究报道的结果相一致[46]。低碳酸盐碱度胁迫下，罗氏沼虾肠道菌群的丰富度显著下降，而多样性指数不论在低碱度或高碱度胁迫下均无显著变化，其原因是水生动物肠道菌群与水体环境中的微生物群落结构存在一定的相关性[47]，而碱度变化可能会影响水体和罗氏沼虾肠道稀有菌群和条件稀有菌群的丰度[48]。已有学者指出，评价肠道健康状况的依据主要是少数致病菌的增加或减少而非总体菌群丰度和多样性的变化[49]，由此本研究更关注罗氏沼虾肠道样品中条件致病菌丰度的变化趋势，如黄杆菌属、假单胞菌属和脱硫弧菌属的丰度上升，三者都是条件致病菌[50]，其成为优势菌可能会增加盐碱水养殖罗氏沼虾幼虾疾病暴发的风险，碳酸盐碱度胁迫对罗氏沼虾幼虾肠道致病菌丰度的调控作用尚有待于深入研究。
4 总结综上所述，罗氏沼虾对碳酸盐碱度表现出较好的耐受性。在本实验条件下，低于3 mmol/L的碳酸盐碱度值条件下，罗氏沼虾能够正常生长繁殖，但当高碳酸盐碱度9 mmol/L慢性胁迫下罗氏沼虾的生长和繁殖均受到显著抑制。组织形态学结果显示，碳酸盐碱慢性胁迫会损害罗氏沼虾幼虾肠道微绒毛结构和围食膜结构，且损伤呈剂量依赖性；高碳酸盐碱慢性胁迫会改变幼虾肠道菌群结构从而增加其患病风险，由此，亟需选育耐盐碱罗氏沼虾良种来有效利用长期闲置碳酸盐型盐碱水资源。
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