2024, Vol. 31 
2. 上海海洋大学海洋生物资源与管理学院，上海 201306
3. 江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏 连云港 222005
4. 江苏省海域执法监督中心，江苏 南通 226006
2. College of Marine Living Resource Sciences and Management, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
3. College of Marine Science and Fisheries, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005, China
4. Jiangsu Fishery Law Enforcement and Supervision Center, Nantong 226006, China
刀鲚(Coilia nasus)，又称长颌鲚，也叫刀鱼、毛花鱼，隶属于鲱形目(Clupeiformes)，鳀科(Engraulidae)，鲚属(Coilia)[1-2]。刀鲚分布于西太平洋区的中国、朝鲜沿海和日本有明海域，其中我国主要分布于东海、黄海以及长江、钱塘江等江河流域[3]。刀鲚鱼肉鲜嫩肥美，营养丰富，是长江重要的经济鱼类之一，但近年来，由于水利工程的修建、高强度捕捞、围垦活动等原因，导致长江口刀鲚产卵场遭到破坏、栖息地环境恶化、资源量下降，长江口刀鲚濒临灭绝，并表现出低龄化和小型化的特点[4]。得益于2020年长江全面禁捕，长江口刀鲚繁殖群体的繁殖性能和健康状况变得良好[5]。
鱼类肠道微生物群落是鱼体的重要组成部分，在维持宿主生长发育、肠道健康、营养代谢、能量吸收和免疫应答等过程中发挥着重要作用[6-10]。鱼类肠道微生物群落的形成十分复杂，其微生物菌群组成除与鱼体本身相关，还受鱼体的生长发育阶段、食物组成、性别和环境因子等因素影响，其中食物组成是影响肠道微生物种类和数量的最主要因素之一[11]，也是改变肠道菌群组成和代谢变化的重要因素[12]。因此，鱼类食物组成的差异可以通过肠道微生物组成结构变化来体现，而肠道微生物组成也可以揭示其不同发育阶段食物组成的变化[13]。
目前关于不同生长发育阶段的洄游型刀鲚，消化不同来源的食物后，其肠道微生物群落结构适应性变化还未有较多研究报道。为此，本研究以长江口刀鲚为研究对象，采用16S rRNA高通量测序技术对刀鲚不同发育阶段肠道微生物V3~V4高变区进行测定，探究刀鲚不同发育阶段随食物组成变化，宿主肠道菌群的群落结构特征，以期为刀鲚资源的保护和合理开发提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 样品采集刀鲚样品取自2022年3月长江口临近海域渔业资源多样性监测调查的张网渔获物，调查站位如图1，按照《海洋渔业资源调查规范》和《海洋监测规范》进行样品采集，监测网具为单桩张纲张网，网具规格为100.0 m×54.9 m (结附网衣的网口纲长×网衣纵向拉紧总长)，样品冷冻保存。
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图1 调查海域及站位分布 Fig. 1 Investigation sea area and sampling stations |
刀鲚样品解冻后进行生物学测定，根据体长范围将其分成3个体长组，即体长≤140 mm为小体型刀鲚，141~200 mm为中等体型刀鲚，≥201 mm为大体型刀鲚，并依次编号L1、L2、L3。表1列出了不同体长组刀鲚的胃和肠道取样信息。
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表1 各体长组刀鲚胃肠样品信息 Tab. 1 Information of the stomach and intestine samples from different body length groups of Coilia nasus |
将不同体长组的刀鲚样品放在无菌操作台上进行处理，所有实验工具均提前进行灭菌处理。首先用75%乙醇将刀鲚体表进行擦拭消毒，随后用灭菌的眼科剪在刀鲚的泄殖孔(肛门)处横着剪开一个小口，随后用剪刀沿着这个小口竖着向上将刀鲚腹部剪开，取胃放入密实袋，置于−80 ℃超低温冰箱中冷冻保存，然后用灭菌的镊子将整个肠道轻挑出来，并分离出肠道，用剪刀从刀鲚的小肠上端将肠道剪下，放入PBS缓冲液中将肠道外壁的黏膜冲洗掉，将处理好的肠道样品收集于提前做好标记的2 mL离心管中，立即放入液氮中速冻，随后放入−80 ℃超低温冰箱保存。每取完一条鱼的肠道后，用纯水对眼科剪和镊子进行清洗，并在酒精灯上再次进行灭菌。由于所选取的刀鲚样品规格差距较大，每组样品的肠道取样数量根据鱼的大小分别取样，每组设置3个平行，即L1 (20尾×3)、L2 (15尾×3)、L3 (10尾×3)，每组的3个平行样品分别合并成为一个样本，共9个样本，每个样本的重量均大于0.2 g，满足16S rRNA肠道微生物测序的样本质量要求。
1.3 胃含物分析方法将刀鲚的胃进行解冻，用吸水纸将表面的水分吸干，用精度为0.001 g的电子天平称重，在体视显微镜下将胃中饵料生物的种类进行鉴定，桡足类根据剩余残体的头胸甲、附肢来鉴别种类[14]；虾类通过大额鉴定种类[14]；鱼类通过耳石进行种类鉴定[15-16]。尽可能鉴定到最小分类单元，并计数和称重。
1.4 肠道内容物总DNA提取和16S rDNA基因扩增将采集到的L1组、L2组和L3组所有肠道组织(含内溶物)样品置于干冰中运送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序分析。DNA提取和测序步骤如下：(1) 根据FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, Norcross, GA, U.S.)试剂盒对刀鲚肠道微生物群落总DNA进行提取，使用分光光度计和1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量。(2) 使用338F (5ʹ-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3ʹ)和806R (5ʹ-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3ʹ)对16S rRNA基因V3~V4可变区进行PCR扩增。利用Illumina公司的MiSq PE300云平台进行测序分析(上海美吉生物医药科技有限公司)。
1.5 数据处理胃含物分析计算公式如下；用SPSS 2021软件对各体长组刀鲚饵料生物组成进行聚类分析，分析前将出现频率(F%)进行平方根转化，去除不可辨饵料生物[17]，以种为分类阶元，聚类方法为瓦尔德法(ward)，测量区间采用欧式距离(euclidean distance)[18]，得到组间聚类谱系图。
| $质量百分比\left( {W\% } \right) = \frac{{某饵料生物的实际质量}}{{饵料生物总质量}} \times 100\% $ |
| $个数百分比\left( {N\% } \right) = \frac{{某饵料生物的个数}}{{饵料生物总个数}} \times 100\% $ |
| $出现频率\left( {F\% } \right) = \frac{{某饵料生物的出现次数}}{{实胃数}} \times 100\% $ |
| $相对重要性指数\left( {\rm{IRI}} \right) = \left( {W\% + N\% } \right) \times F\% $ |
| $相对重要性指数百分比\left( {{\rm{IRI}}\% } \right) = \frac{{\rm{IRI}}}{{\sum {\rm{IRI}} }} \times 100\% $ |
利用fastp v0.20.0[19]、Flash v1.2.7[20]和UPARSE v7.1[21]对刀鲚肠道微生物群落测序原始数据进行质控(quality control)、过滤(quality filtered)、拼接(merged)和去除嵌合体(chimera removed)，得到相似性在97%以上的OTU序列表格，基于此表格对刀鲚肠道微生物物种组成、Alpha多样性、Beta多样性、ASV韦恩图、主坐标成分和显著性差异菌群进行分析。
用Alpha多样性来描述刀鲚肠道微生物群落的物种丰富度和多样性，以ACE指数和Chao1指数表征丰富度，以Shannon指数和Simpson指数表征多样性，以Coverage指数表征覆盖度，计算公式：
| ${S_{\rm{ACE}}} = {S_{{\rm{abund}}}} + \frac{{{S_{{\rm{rare}}}}}}{{{C_{\rm{ACE}}}}} + \frac{{{F_1}}}{{{C_{\rm{ACE}}}}}\gamma _{\rm{ACE}}^2$ |
| $\gamma _{{\rm{ACE}}}^2 = \max \left[ {\frac{{{S_{{\rm{rare}}}}\sum\limits_{i = 1}^{10} i (i - 1){F_i}}}{{{C_{\rm{ACE}}}{N_{{\rm{rare}}}}({N_{{\rm{rare }}}} - 1)}} - 1,0} \right]$ |
| ${C_{\rm{ACE}}} = 1 - \frac{{{F_1}}}{{{N_{{\rm{rare}}}}}}$ |
| ${N_{{\rm{rare}}}} = \sum\limits_{i = 1}^{10} i {F_i}$ |
式中，Sabund为高丰度物种(丰度>10); Srare为稀有物种(丰度≤10且不为0); F1为丰度为1的物种；CACE为样本覆盖度的估计值；γ2 ACE为稀有物种的变异系数。
| ${\rm{ Chao}}1 = {\rm{ Sobs }} + {n_1}({n_1} - 1)/2({n_2} + 1)$ |
式中，Chao1为估计的OTU数；Sobs为观测到的OTU数；n1为只有1条序列的OTU数目为n2为只有2条序列的OTU数目。
| ${H_{{\rm{Shannon }}}} = - \sum\limits_{i = 1}^S {{P_i}} {\log _2}{P_i}$ |
| ${D_{{\rm{Simpson }}}} = 1 - \sum\limits_{i = 1}^S {P_i^2} $ |
式中，S为物种数目；Pi为属于种i的个体在全部个体中的比例。
Beta多样性是通过聚类分析(UPGMA)和主坐标分析(PCoA)来比较不同生态系统之间的差异，反映生物种类因环境所造成异质性。ANOSIM是基于相似性(距离矩阵)的非参数检验，由于不要求数据正态分布和方差齐性，非常适用于微生物群落这种样本分布不确定的复杂分析。
LEfSe分析一般用以强调统计学意义和生物学相关性，采用该分析方法可以检测刀鲚不同组间的差异菌群，以作为区分不同体长组间刀鲚肠道的微生物标记。
2 结果与分析 2.1 胃含物分析结果对811尾刀鲚进行胃含物分析，根据相对重要性指数百分比(IRI%)，表明不同体长组刀鲚均以桡足类和线虫类为主要饵料类群(表2)，但桡足类和线虫类的占比在不同组间变化较大。根据聚类分析可以将3个体长组的食物组成分为两大类，即L1聚为一类(≤140 mm), L2和L3聚为一类(>140 mm) (图2)，即随着体长的增长，L2和L3刀鲚摄食桡足类的占比逐渐下降，十足类和线虫类的占比逐渐增加，且摄食的饵料种类增多。
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表2 刀鲚主要饵料种类出现频率百分比(F%)和相对重要性指数百分比(IRI%) Tab. 2 Frequency of occurrence (F%) and percentage of relative importance index (IRI%) of main feed species of Coilia nasus % |
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图2 刀鲚不同体长组食物组成聚类分析 Fig. 2 Cluster analysis of food composition of Coilia nasus for different body length groups |
利用Illumina公司MiSeq PE300平台对刀鲚不同体长组共9个肠道样品进行16S rRNA测序分析，对所有样本序列进行抽平，使其达到相同的测序深度(每个样本33201读数)，共获得298809条有效序列，根据97%的相似度进行OTU分类，共获得1489个OTU。利用OTU Sobs稀释浓度曲线来检测刀鲚肠道菌群的测序深度和物种丰富度(图3)，从图中可以看出随刀鲚肠道样本量的增加，稀释度曲线趋于平缓，显示了清晰的渐进线，说明测序量充足，表明本研究中对刀鲚肠道菌群的采样接近完整，能代表本研究样品中的物种多样性。
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图3 刀鲚不同体长组肠道菌群样品的稀释曲线 Fig. 3 Dilution curves of intestinal microbial samples of Coilia nasus in different body length groups |
通过对3组样本的肠道微生物组成分析，共鉴定出726个属，378个科，隶属于30个门。如图4a所示，在门分类水平上，刀鲚不同组间的优势菌群种类相似，均主要以放线菌门(Actinobacteriota)和变形菌门(Proteobacteria)构成，但优势菌门在3组中有较大差异。L1组以放线菌门(84.1%)为主要优势菌门，变形菌门(11.8%)为次优势菌门；L2组和L3组以变形菌门(53.6%、53.1%)为主要优势菌门，放线菌门(38.1%、28.7%)为次优势菌门；其中浮霉菌门(Planctomycetota)(1.0%)仅在L3组这类大个体刀鲚中检测到，L1和L2等中小型个体中均不存在。3种体型刀鲚的肠道中放线菌门和变形菌门均占细菌相对丰度的80%以上，这一结果表明放线菌门和变形菌门是刀鲚肠道的优势菌门。
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图4 刀鲚不同体长组肠道菌群在不同分类水平上的相对丰度a：门水平；b：属水平. Fig. 4 Relative abundance of gut microbiota for different body length groups of Coilia nasus at different taxonomic levelsa: phylum level；b: genus level. |
取属水平丰度前10的菌属进行分析，如图4b所示，不同组间刀鲚肠道菌群的丰度差异较大。红球菌属(Rhodococcus)是不同体长组刀鲚肠道中的共同优势菌属，在L1组中丰度最高(82.0%), L3组中最低(27.0%)，说明随体长的增长，红球菌属占比逐渐下降；发光杆菌属(Photobacterium)在3组间均存在一定的占比，是L2和L3的共同优势菌属，但发光杆菌属在L1中的丰度较低，说明随着体长的增长这种菌属丰度逐渐增加；红球菌属、发光杆菌属、另类弧菌属(Aliivibrio)属和代尔夫特菌属(Delftia)是L2中的优势菌属，且另类弧菌属仅在L2组出现；红球菌属、发光杆菌属和其他菌群(序列百分比≤1%)和螺旋菌门属(Spirochaetota)是L3中的优势菌属，其中螺旋菌门属仅在L3组中出现。以上结果表明，随着刀鲚个体大小的增加，刀鲚肠道中的微生物种类也增多，这可能与不同体型刀鲚的摄食习性有关。
2.4 Alpha多样性分析对刀鲚不同体长组肠道菌群Alpha多样性进行分析，结果显示L2组肠道菌群ACE指数和Chao1指数最大，其次是L3组，最后是L1组，表明L2组刀鲚肠道菌群的丰富度最高，L1组最低，Shannon指数在L1组中最低，L2和L3组相同，但L3组刀鲚肠道菌群分布更广泛，表明刀鲚肠道微生物多样性随体长增加而增加，Simpson指数显示L2组最小，L1组最大，表明L2组刀鲚肠道微生物群落多样性最高，L1组最低(表3), Simpson指数差异可能是由于L2组和L3组刀鲚肠道取样的质量存在差异。
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表3 刀鲚不同体长组肠道菌群Alpha多样性指数分析 Tab. 3 Alpha diversity indices of intestinal microbiota of Coilia nasus in different bady length groups |
韦恩图(图5)表示组间共享或特有的OTU。L1、L2和L3分别观察到448个、886个和707个OTU。L1、L2和L3序列文库共享164个OTU, L1和L2共享99个OTU, L1和L3共享46个OTU, L2和L3共享87个OTU，从组间特有的OTU数目来看，L1与L3差距较大，说明L1和L3在肠道微生物组成上存在较大差异，而L2的OTU数量最多，这可能是由于L2组刀鲚肠道样本选取的重量与L3组存在有所差异。
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图5 刀鲚不同体长组肠道菌群中OTU重叠的Venn图图中的重叠部分代表3组中共享OTU的数目，非重叠部分的数字代表对应中所特有的OTU数目. Fig. 5 Venn diagram of OTU overlap in gut microbiota of different body length groups of Coilia nasusThe overlapping parts of the figure represent the number of shared OTUs in the three groups, and the numbers in the non-overlapping parts represent the number of OUTs unique to their counterparts. |
为了研究不同体长组间肠道样本细菌群落结构的相似性或差异关系，利用Bray-Curtis距离算法对门水平上的肠道微生物群落物种进行样本层级聚类分析，并构建树状聚类分析图。如图6所示，放线菌门是L1组中的优势菌群，变形菌门是L2和L3的优势菌群，且L1单独聚为一类，L2和L3聚为一类，这一结果与胃含物的聚类结果一致，说明食物组成与肠道菌群组成密切相关。
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图6 刀鲚不同体长组肠道菌群的聚类分析 Fig. 6 Cluster analysis of gut microbiota of Coilia nasus in different body length groups |
使用加权(weighted unifrac)距离算法对不同组间肠道菌群进行分析，PCoA分析表明(图7)，不同组间肠道菌群出现分离，L1组单独聚在一起，L2和L3组聚在一起，说明L1与L2和L3的肠道菌存在较大差异，L2和L3的肠道菌群组成类似，且通过ANOSIM组间差异检验显示不同组间的刀鲚肠道菌群存在差异(P<0.05, R>0.25)。
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图7 刀鲚不同体长组肠道菌群PcoA分析 Fig. 7 Analysis of PcoA in different body length groups of Coilia nasus |
如图8所示，嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和短杆菌属(Brevibacterium)在L1组富集；链霉菌属(Streptomyces)和希瓦氏菌属(Shewanella)在L2组富集；TM7a属在L3组富集。通过LDA判别柱形图可以看出(图9)，嗜冷杆菌属、活动球菌属(Planococcaceae)、短杆菌属和双歧杆菌科(Brevibacteriaceae)为L1组中的显著性差异菌群，LDA值均大于3；链霉菌属、希瓦氏菌属和经黏液真杆菌属(Blautia)为L2组中的显著性差异菌群，LDA值均大于3; TM7a属为L3组中的显著性差异菌群。总体来看，LEfSe分析和LDA判别结果具有一致性，即嗜冷杆菌属可以作为区分L1和其他两个体长组的微生物标记；链霉菌属和希瓦氏菌属可以作为区分L2与其他两个体长组的微生物标记物；TM7a属可以作为区分L3与其他两个体长组的微生物标记物。
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图8 刀鲚不同体长组肠道菌群LEfSe多级物种图 Fig. 8 LEfSe multilevel species map of gut microbiota of Coilia nasus in different body length groups |
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图9 刀鲚不同体长组肠道菌群LDA判别柱形图 Fig. 9 LDA discriminant histogram of gut microbiota in different body length groups of Coilia nasus |
研究发现刀鲚的食物组成与肠道微生物群落多样性密切相关。以不同体长组刀鲚食物组成的出现频率(F%)进行聚类分析的结果与之对应的肠道微生物群落层次聚类一致，均将3个不同体长组聚为两大类，即L1为一类，L2和L3聚为一类，并在此基础上通过16S rRNA测序技术对不同体长组刀鲚肠道微生物群落的多样性和组成进行了初步分析。结果表明，L2和L3组Shannon指数高于L1，说明随着体长的增加，刀鲚肠道菌群多样性增高。窦硕增等[22]、Ma等[23]研究发现，同种鱼类的食物来源会因其生活环境和个体生长发育的变化而变化，使其肠道微生物群落也随之发生变化；Miyake等[24]发现杂食性鱼类褐斑刺虾虎鱼(Acanthurus nigrofuscus)幼鱼主要的饵料生物为藻类，而成鱼的主要饵料生物则为浮游动物，两者肠道群落结构具有显著变化；Moran等[25]对悉尼鸵鱼不同生长发育阶段肠道微生物菌群的研究发现，肠道微生物群落随宿主食物组成变化而有所差异，并且食性变化前后肠道微生物多样性也会随之增加。可见随着鱼体的生长和饵料生物的变化，肠道中微生物菌群为了消化不同种类的食物而增多，微生物多样性也随之增加。在本研究中，刀鲚在L1 (≤140 mm)中以桡足类为主要饵料，随着个体生长发育，L2和L3阶段桡足类出现频率逐渐下降，刀鲚开始摄食十足类、鱼类和多毛类等饵料生物，且十足类和线虫类的出现频率逐渐增加，说明刀鲚随着体长的增长，其食物组成和饵料丰富度都发生变化，肠道微生物群落多样性也随之增加，与Moran等[25]的研究结果相符，证实了刀鲚的食物组成会因个体生长而变化，宿主的肠道微生物群落也会随之发生改变。
3.2 刀鲚的摄食习性与肠道微生物群落结构组成密切相关通过对不同体长组刀鲚肠道菌群群落组成分析，发现刀鲚肠道微生物群落结构组成会随着其摄食习性的变化而发生改变。有研究表明，变形菌门和放线菌门是多种鱼类肠道的优势菌群[26]，如敖梦雪[27]发现婴幼儿时期长江江豚(Neophocaena asiaeorientalis)的优势菌群为变形菌门和放线菌门；蔡斌斌[28]发现白甲鱼(Onychostoma sima)的优势菌门也为变形菌门和放线菌门等；常亚娟等[29]发现长江日本鳗鲡(Anguilla japonica)幼体肠道菌群主要是变形菌门。本研究结果显示，刀鲚优势菌门为放线菌门和变形菌门，这一结果与聂志娟等[30]对长江刀鲚体内优势菌群研究结果一致；而浮霉菌门(Planctomycetota)仅存在于大个体刀鲚(L3)肠道中，与姜敏等[31]发现南通江段刀鲚(>200 mm)肠道中存在浮霉菌门结果一致。研究表明，浮霉菌门多存在于厌氧环境下，并且包含多种厌氧氨氧化菌，在底泥中相对含量较高[32]，而刀鲚仔稚鱼和幼鱼一般生活在中上层水域，以桡足类等小型浮游动物为食；成鱼栖息于水质较浑浊的底层水域中，主要以虾类和其他动物的幼体为食[33]，使得浮霉菌门在肠道中占有一定比例，进一步证明刀鲚不同发育阶段的摄食习性会影响其肠道微生物群落结构组成。
3.3 刀鲚的生活环境影响肠道微生物群落结构组成研究表明，水生生物在不同的生活环境下其肠道微生物的组成存在差异[34]。本研究中，在属水平上，红球菌属是3组间共同的优势菌群，该菌具有积累脂质的功能[35]，刀鲚洄游主要依靠体内积累的营养物质完成整个洄游生殖，而脂肪是刀鲚的主要营养素之一[36]。发光杆菌属在3组刀鲚肠道内均存在一定的比例，有研究发现，该类菌属在鱼类肠道中可作为共生菌协助几丁质的消化[37]。螺旋菌门的短螺旋体属(Brevinema)仅在L3组中被发现，该类型的菌通常在草食性的鱼类中出现较多[37]。Duan等[38]在太湖刀鲚中发现肠道菌群以拟杆菌属(Bacteroides)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、盐单胞菌属(Halomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、颤螺菌属(Oscillospira)为主。李辰钰等[39]在长江干流(彭泽段)、鄱阳湖、青草沙水库和嵊泗海域4个水域的刀鲚中发现肠道菌群主要以赫夫勒氏菌属(Hoeffea)、沙雷氏菌属(Serratia)、梭菌属(Clostridium)、球杆菌属(Phocaeicola)、嗜冷杆菌属、青枯菌属(Ralstonia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、拟杆菌属、代尔夫特菌属为主。另外，发现嗜冷杆菌属可以作为区分L1和其他两组的微生物标记物，这类菌群已经被归为益生菌类[37]，链霉菌属可以作为区分L2和其他两组的微生物标记物，这类菌群可以诱发水生动物的免疫反应、增强抗菌抗病毒活性、改善胃肠道微菌群以及通过氮固定和有机残基的降解来改善水质[40]，而TM7a属作为区别L3与其他两组的微生物标记物在鱼类肠道中发挥的作用还有待进一步研究，这3种差异菌群可能与刀鲚洄游所经过的水域有关。
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