2024, Vol. 31 
2. 中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090
3. 自然资源部宁波海洋中心，浙江 宁波 315012
2. Key Laboratory of East China Sea Fishery Resources Exploitation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China
3. Ningbo Marine Center, Ministry of Natural Resources, Ningbo 315012, China
东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)是我国近海主要的赤潮生物之一，对环境适应能力较强，赤潮暴发时对我国沿海生态系统平衡及海水养殖业造成严重危害[1]。东海原甲藻赤潮的发生是由其细胞在特定环境条件下短时间内快速增殖和聚集引发的，因此了解环境影响下藻细胞快速增殖的内在机理是研究赤潮形成和预防措施的关键。课题组通过正交试验发现，光照强度、盐度、pH、温度和氮磷比(N/P比)不同水平的组合可造成东海原甲藻细胞增殖速度的极大差异(待发表)，但其内在机理尚不清楚。细胞周期是调控细胞分裂重要的生物学过程，环境因子能够通过改变浮游植物的细胞周期进程来影响其增殖速度[2-6]。因此，探究不同增殖速度的东海原甲藻细胞周期特点，解析其分子调控机制可阐释藻细胞增殖速度对环境因素响应的内在机理。
东海原甲藻具有典型的真核生物细胞周期，包括G1期、S期、G2期和M期[7-8]。随着蛋白质组学和转录组学技术的发展，与东海原甲藻细胞周期相关的蛋白和基因逐步被鉴定出来[9-12]。Wang等[8]利用定量蛋白质组学技术对东海原甲藻细胞周期调控进行了研究，结果表明增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表达量在S期达到峰值。张英娇[9]利用定量蛋白质组学技术研究了东海原甲藻细胞周期不同时相的蛋白质表达谱，成功鉴定到了细胞分裂周期蛋白48 (cell division cycle protein 48, Cdc48)和细胞分裂周期蛋白(cell division cycle protein, Cdc) 2种细胞周期相关蛋白。Shi等[7]克隆了东海原甲藻的G1/S细胞周期蛋白基因，并证实其功能与G1期到S期的转变有关。这些研究为了解东海原甲藻细胞周期特点及调控奠定基础，但对于不同增殖速度的东海原甲藻细胞周期进程的差异及其调控机制尚不能解析。
前期研究成果表明不同环境因子水平组合显著影响东海原甲藻细胞增殖速度(待发表)，基于此，从中选择两种能够造成东海原甲藻细胞增殖速度显著差异的环境因子组合，通过流式细胞检测技术对比分析了两实验组东海原甲藻细胞周期时相的差异；利用转录组测序技术对比研究获得差异表达基因及参与途径；鉴定与细胞周期相关的功能基因并解析其在细胞周期进程中的作用。本研究有助于深入理解外部环境如何通过影响藻细胞周期，改变细胞增殖速度进而引发赤潮。
1 材料与方法 1.1 藻种来源及同步化培养东海原甲藻细胞购于上海光语生物科技有限公司。人工海水(盐度30, pH 8.0)经0.22 μm混合纤维素滤膜过滤后，121 ℃高温灭菌20 min。待海水冷却后在超净工作台中加f/2培养基。随后加入卡那霉素、氨苄青霉素和链霉素，终浓度依次为50、50、25 μg/mL。配制完成后，将藻细胞转接到培养液中。培养条件设置为温度20 ℃，光照强度37 μmol/(m2·s)，光暗比为14 h∶10 h（光照时间8:00~22:00，黑暗时间22:00~8:00）。
为使东海原甲藻细胞处于相同的细胞周期时相，用连续黑暗处理的方法对藻细胞进行细胞周期同步化[13]。当藻细胞浓度长到1.5×105~2.0× 105 cells/mL时，用透气黑布对装有藻液的三角烧瓶进行避光处理，连续避光培养48 h，完成细胞周期同步化。同步化效率用流式细胞仪进行检测。
1.2 实验设计与取样根据前期正交试验结果(待发表)，分别选取东海原甲藻增殖速度较慢的环境因子组合(第3组)和增殖速度较快的环境因子组合(第16组)作为实验组。第3组的培养条件为：光照强度20 μmol/(m2·s)、盐度25、pH 8.5、温度25 ℃、N/P (NO3‒-N浓度与PO43‒-P浓度摩尔比) 32；第16组的培养条件为：光照强度160 μmol/(m2·s)、盐度30、pH 7.5、温度25 ℃、N/P16。基于近年来我国东海海域中NO3‒-N浓度，将实验组培养基中NO3‒-N浓度固定设置为60 μmol/L。
同步化处理完成后的第2天进行转接。取2 L藻液，4 ℃下5500 g离心5 min，去除上清后将藻细胞分别转接到已配制好的两实验组3 L新鲜培养液中，使接种密度为1.2×105~1.3×105 cells/mL，随后将东海原甲藻细胞置于两种不同环境条件下培养24 h并取样。
1.2.1 细胞计数取样转接当天的18:00开始取样，每2 h取样1次。用Lugol's碘液固定1 mL藻细胞并用浮游植物计数板在光学显微镜下计数，重复2次，取平均值。
1.2.2 细胞周期取样转接当天的20:00开始，每2 h取样1次，取50 mL藻液，5500 g, 4 ℃，离心5 min弃去上清，加入1 mL PBS (Gibco™, USA)重悬细胞。将3 mL经−20 ℃预冷的无水乙醇缓慢加入细胞悬液中，−20 ℃固定过夜。固定好后4 ℃下5500 g离心弃去上清。用PBS洗涤一次，重复离心步骤弃去上清。加入1 mL DNA staining solution (联科生物，中国)，涡旋振荡5~10 s混匀。室温避光孵育30 min，使用Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher, USA)检测两实验组东海原甲藻细胞周期时相。
1.2.3 转录组测序取样分别取第3组和第16组转接前(18:00)，转接后19:00、8:00、10:00、14:00共10个实验组的藻细胞样品。按时间先后顺序，第3组的样品分别记为C1、C2、C3、C4、C5，第16组的样品分别记为T1、T2、T3、T4、T5。收集的藻液于4 ℃下5500 g离心5 min后去除培养基，保留藻细胞，速冻于液氮中。于−80 ℃下保存备用，每组样品设置3个平行样。
1.3 RNA文库构建和测序使用Invitrogen TRIzol试剂盒提取总RNA。总RNA质量用琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100 Bioanalyzer检测。检测合格后，构建文库并进行质检与测序。
1.4 原始数据的处理与拼接测序完成后，过滤、整理原始下机数据，去除带接头、长度小于50 bp、序列平均质量在Q20以下的read，并进行有效数据统计。随后使用Trinity 2.15.1软件对得到的高质量序列进行从头拼接得到Unigene集。
1.5 基因功能注释Unigene基因功能注释所用到的数据库包括NR (NCBI non-redundant protein sequences)、GO (gene ontology)、KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genome)、eggNOG (evolutionary genealogy of genes: non-supervised orthologous groups)、Swiss-Prot和Pfam。
1.6 差异表达分析使用转录组表达定量软件RSEM计算每个基因的FPKM值(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)。随后采用DESeq筛选出表达量差异显著的基因，即表达差异倍数|log2foldchange|>1，显著性P<0.05。使用topGO进行GO富集分析，通过超几何分布方法计算P，显著富集的标准为P<0.05。
1.7 与细胞周期调控相关的差异表达基因筛选及验证通过DESeq筛选出两实验组中与细胞周期调控相关的表达量有差异显著的基因共10个，为cyclin A1-1基因(CYCA, TRINITY_DN37763_c0_ g1)、G2/mitotic-specific cyclin-B基因(CYCB, TRINITY_DN30072_c0_g2)、cyclin-U4-1基因(CYCU, TRINITY_DN17614_c0_g1)、2个cyclin-dependent kinase 1 (CDK1)基因(TRINITY_ DN7569_ c3_g1、TRINITY_DN56240_c0_g1)、4个cyclin-dependent kinase 2 (CDK2)基因(TRINITY_DN40606_ c0_g1、TRINITY_DN478_c2_g1、TRINITY_DN59034_ c0_g1、TRINITY_DN11316_c0_g1)和Cdc48基因(TRINITY_DN12999_c0_g2)。
相较于转录组数据中基因的FPKM值而言，实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)技术通过与稳定的内参基因相比较，能更加准确地反映差异基因的表达水平[14]。因此，通过qRT-PCR技术分别对上述10个基因在第3组和第16组中的表达谱进行验证。目标基因验证引物用Primer Premier 6.25设计，以东海原甲藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因为内参基因[7]。由上海派森诺生物科技股份有限公司合成(表1)。RNA提取完成后逆转录成cDNA链，以cDNA为模板进行扩增，每个样品设置3个重复。使用2–ΔΔCt方法进行基因相对表达量计算，ΔCt=目标基因Ct值–GAPDH基因Ct值。
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表1 不同增殖速度的东海原甲藻差异表达基因的qRT-PCR验证引物序列信息 Tab. 1 qRT-PCR validation primer sequences for differentially expressed genes of Prorocentrum donghaiense with different proliferation rates |
鉴于样本量较小，使用IBM SPSS Statistics 29.0.2.0软件中非参数检验方法(Mann-Whitney U test)对数据进行差异显著性分析。使用R语言4.2.2进行绘图。
2 结果与分析 2.1 不同环境条件下东海原甲藻24 h内细胞密度变化由图1可知，两实验组东海原甲藻培养初始密度无显著性差异(P>0.05)。转接24 h后，第16组的细胞密度相较于初始密度显著增加(P<0.01)，增加幅度为59.32%；第3组的细胞密度相较于初始密度增加(P<0.05)，增加幅度为17.02%；此时两组细胞密度差异显著(P<0.05)。培养过程中，第16组细胞密度在2:00~10:00呈明显上升趋势，10:00其细胞密度达到峰值，与初始密度相比增长73.60%。
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图1 不同环境条件下东海原甲藻24 h内细胞密度变化 Fig. 1 Changes of cell density of Prorocentrum donghaiense during 24 h under different environmental conditions |
由图2可知，通过连续黑暗处理使东海原甲藻细胞同步化后，藻细胞同步性良好，在接入两实验组培养基时，细胞周期时相100%集中在G1期。转接后的24 h内，两组细胞的细胞周期进程存在差异。两实验组S期的细胞占比呈先上升后下降的趋势，至4:00均达到峰值。不同的是，第16组在24:00有0.94%的细胞进入S期，比第3组细胞提前2 h；第3组在10:00 S期的细胞周期占比降为0，而第16组在14:00占比降为0。总体来看，第16组S期时长比第3组多6 h。
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图2 不同增殖速度的东海原甲藻细胞24 h内周期各时相占比a：第3组；b：第16组. Fig. 2 The proportion of Prorocentrum donghaiense cells with different proliferation rates in different cell cycle phases during 24 ha: Group 3；b: Group 16. |
此外，两实验组G1期和G2/M期细胞占比变化情况也有所不同(图2)。随着细胞进入S期，第16组G1期细胞占比相较第3组提前2 h开始下降，至4:00均达到最低值后G1期细胞占比开始上升。然而，第3组在6:00至8:00上升幅度大于第16组，且8:00第3组G1期细胞占比(92.83%)显著高于第16组(86.62%)(P<0.01)。第16组在8:00~10:00 G1期细胞占比显著升高(P<0.01)，随后逐渐升高直至第2天20:00占比为100%。两实验组至4:00起均有部分细胞进入G2/M期，G2/M期细胞占比在8:00达到峰值，且此时第16组的G2/M期细胞占比峰值高于第3组(P<0.05)。第16组细胞在14:00至20:00细胞几乎全部进入G1期；而第3组细胞从14:00开始至培养结束均有超过1.3%的细胞处在G2/M期。
2.3 测序与组装结果两实验组的10个样品经过上机测序后生成原始读序(raw reads)，经过滤、整理、拼接后得到了362814个转录本，总长度378800006 bp，平均长度1044.06 bp, N50为1444 bp, GC含量64.26%。并得到149219个unigene，总长度155893105 bp，平均长度1044.73 bp, N50为1501 bp, GC含量64.07% (表2)。测序与组装结果符合后续注释分析的要求。原始数据上传至NCBI数据库，序列登录号为PRJNA1125908。
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表2 不同增殖速度的东海原甲藻细胞测序拼接后转录本结果统计 Tab. 2 Statistical analysis of transcriptome results of Prorocentrum donghaiense with different proliferation rates |
细胞周期调控蛋白确保浮游植物细胞周期各时相有序正确完成，这些蛋白包括细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)、细胞分裂周期蛋白(cell division cycle protein, Cdc)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDK inhibitor, CKI)等[2]。
在东海原甲藻中注释到多种细胞周期相关蛋白基因，包括49个cyclin基因、74个CDK基因、26个CDC基因、11个PCNA基因(表3)。细胞周期蛋白基因共分为11类，其中CYCU和CYCB数量最多，分别注释到16个和12个unigene。细胞周期蛋白依赖性激酶基因共分为16类，其中Cdc2属于CDK1的一种[15]。在所有CDK基因中，Cdc2数量最多，共注释到16个unigene。细胞分裂周期蛋白基因共分为8类，其中Cdc48数量最多，共注释到15个unigene。增殖细胞核抗原基因共注释到2类，PCNA和PCNA2，分别注释到10个和1个unigene。由于浮游植物细胞周期调控蛋白基因研究背景相对较弱，本研究中转录组未注释到编码CKI基因。
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表3 东海原甲藻细胞周期相关蛋白基因注释汇总 Tab. 3 Summary of the annotated cell cycle protein genes in Prorocentrum donghaiense |
根据第3组和第16组细胞周期时相存在差异的时间点，两两比较两实验组接种后8:00 (C3、T3)、10:00 (C4、T4)和14:00 (C5、T5)的基因表达量，统计差异表达基因数量和差异表达基因的GO富集分类(表4和图3)。
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表4 不同增殖速度的东海原甲藻细胞基因表达差异分析数据统计 Tab. 4 Statistical analysis of gene expression differences in Prorocentrum donghaiense cells with different proliferation rates |
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图3 不同增殖速度的东海原甲藻细胞差异表达基因GO富集分析气泡图a. T3 vs. C3; b. T4 vs. C4; c. T5 vs. C5. Fig. 3 Bubble diagram of GO enrichment analysis of differentially expressed genes in Prorocentrum donghaiense cells with different proliferation ratesa. T3 vs. C3; b. T4 vs. C4; c. T5 vs. C5. |
通过GO富集分析，T3与C3相比富集程度较大且富集较为显著的GO分类依次为ATP酶活性、催化复合体、微管细胞骨架，其次为超分子聚合物、超分子纤维、质膜边界细胞突起；T4与C4相比富集程度较大且富集较为显著的前3种GO分类依次为有机环状化合物结合、杂环化合物结合、细胞骨架、催化复合体，其次为微管细胞骨架、超分子聚合物、超分子纤维；T5与C5相比，上调基因数量与下调基因数量相较于前两个时间段均下降，富集程度较大且富集较为显著的前3种GO分类依次为质膜边界细胞突起组织、微管束的形成、蛋白质发色团连接，其次为纤毛依赖性细胞运动、纤毛或鞭毛依赖的细胞运动、鞭毛轴丝装配。
2.6 细胞周期调控蛋白基因的表达差异验证在注释到的49个编码细胞周期蛋白的基因中，两实验组差异表达的基因有3个，即CYCA、CYCB和CYCU。实时荧光定量PCR验证结果表明，第16组中CYCA和CYCB相对表达量在转接后均呈现“先升后降”的趋势，第3组中CYCA相对表达量在转接后呈现“先升后降又升”的趋势，CYCB相对表达量与第16组一样在转接后呈现“先升后降”的趋势(图4a，图4b)。第3组中CYCA和CYCB相对表达量在8:00升高，且此时这两个基因的相对表达量分别显著高于第16组中CYCA和CYCB的相对表达量(P<0.05)；第16组中CYCA和CYCB相对表达量在10:00升高，且此时这两个基因的相对表达量分别显著高于第3组中CYCA和CYCB的相对表达量(P<0.05)。CYCU的相对表达量则表现为“先降后升”的趋势，两实验组中CYCU的相对表达量最低值均出现在10:00，且此时第16组CYCU的相对表达量显著高于第3组(P<0.05)。
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图4 不同增殖速度的东海原甲藻细胞周期蛋白差异表达基因表达模式a. CYCA; b. CYCB; c. CYCU. *表示差异显著(P<0.05). Fig. 4 Transcriptional profile of the differentially expressed genes encoding cyclin in Prorocentrum donghaiense cells with different proliferation ratesa. CYCA; b. CYCB; c. CYCU. * indicates significant difference (P<0.05). |
在注释到的74个编码细胞周期蛋白依赖性激酶基因中，两实验组差异表达的基因有6个，包括2个CDK1基因、4个CDK2基因。CDK1基因TRINITY_DN7569_c3_g1的相对表达量在第3组和第16组中均呈“先升后降”的趋势，第3组中其最高值出现在8:00，第16组中出现在10:00，且此时其相对表达量显著高于第3组(P<0.05)(图5a)。CDK1基因TRINITY_DN56240_c0_g1的相对表达量在第3组中呈“先升后降”的趋势，在第16组中则表达稳定，且在接种后的3个时间点时第3组的相对表达量均显著高于第16组(P<0.05)(图5b)。编码CDK2的4个基因在第16组中均呈“先升后降”的趋势，且接种后基因相对表达量最低值均出现在14:00。然而，这4个基因在第3组的表达模式则各有不同。CDK2基因TRINITY_DN40606_c0_g1在第3组中“先降后升”, 8:00和10:00是其相对表达量显著低于第16组(P<0.05)。CDK2基因TRINITY_DN478_c2_g1和TRINITY_DN11316_c0_g1在第3组接种后两个时间点的相对表达量变化不大，相对表达量在10:00均显著低于第16组(P<0.05)；在14:00相对表达量升高，并显著高于第16组(P<0.05)(图5d和图5e)。第3组中CDK2基因TRINITY_ DN59034_c0_g1相对表达量在8:00升高后变化不大，其相对表达量在10:00显著低于第16组，在14:00则显著高于第16组(图5f)。
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图5 不同增殖速度的东海原甲藻细胞周期蛋白依赖性激酶差异表达基因表达模式a. CDK1 (TRINITY_DN7569_c3_g1); b. CDK1 (TRINITY_DN56240_c0_g1); c. CDK2 (TRINITY_DN40606_c0_g1); d. CDK2 (TRINITY_DN478_c2_g1); e. CDK2 (TRINITY_DN11316_c0_g1); f. CDK2 (TRINITY_DN59034_c0_g1). *表示差异显著(P<0.05). Fig. 5 Transcriptional profile of the differentially expressed genes encoding cyclin-dependent kinases in Prorocentrum donghaiense cells with different proliferation ratesa. CDK1 (TRINITY_DN7569_c3_g1); b. CDK1 (TRINITY_DN56240_c0_g1); c. CDK2 (TRINITY_DN40606_c0_g1); d. CDK2 (TRINITY_DN478_c2_g1); e. CDK2 (TRINITY_DN11316_c0_g1); f. CDK2 (TRINITY_DN59034_c0_g1). * indicates significant difference (P<0.05). |
注释到的26个编码细胞分裂周期蛋白基因中，在两实验组中差异表达的基因有1个(图6)，即Cdc48。第3组中Cdc48的相对表达量较为稳定。在第16组中其相对表达量在10:00升高，并显著高于第3组(P<0.05)，至14:00，其相对表达量下降至初始水平。
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图6 不同增殖速度的东海原甲藻细胞分裂周期蛋白Cdc48差异表达基因表达模式*表示差异显著(P<0.05). Fig. 6 Transcriptional profile of the differentially expressed genes encoding cell division cycle protein Cdc48 in Prorocentrum donghaiense cells with different proliferation rates* indicates significant difference (P<0.05). |
目前实现东海原甲藻细胞同步化的方法有多种，包括一次性光限制同步化、连续光限制同步化、离心同步化、周期垂直移动同步化和黑暗诱导同步化等[9,13]。本研究使用黑暗诱导同步化方法使细胞100%集中在G1期，结果与李美贞[13]的研究结果一致，表明实验用东海原甲藻的细胞同步化良好。
根据细胞周期时相检测发现，在8:00东海原甲藻G2/M期细胞占比最高，结合细胞密度在10:00达到峰值推测该藻细胞分裂主要在8:00，此时细胞处于G2/M期[8]。然而，增殖速度较快的实验组(第16组)在8:00 G2/M期细胞占比显著高于增殖速度较慢的实验组(第3组)。第16组在10:00 G2/M期细胞占比下降幅度和G1期细胞占比上升幅度显著大于第3组，且第3组在8:00 G1期细胞占比开始上升，表明两实验组由G2/M期到G1期过渡的时间有差异。同样，第16组细胞在14:00~20:00细胞几乎全部进入G1期；而第3组细胞从14:00开始至培养结束均有超过1.3%的细胞处在G2/M期，这表明此时两实验组进入G1期，而第3组有部分细胞阻滞在G2/M期，没有完成细胞分裂回到G1期。此外，第16组比第3组细胞提前2 h进入S期，且S期时长比第3组多6 h。在李美贞[13]与张英娇[9]的研究中，增殖速度与16组接近的实验组，东海原甲藻的S期时长为14 h，与本研究结果相一致。因此，第3组的S期时长更短，从而导致进入G2/M期的细胞较少。综上所述，两组细胞增殖速度的差异与第3组S期更短及G2/M期阻滞有关。
3.2 细胞周期相关基因对细胞周期的调控根据细胞周期时相比较可知，第16组和第3组在8:00、10:00和14:00这3个时间点细胞周期时相差异显著。因此，对这3个时间点两实验组的转录组比较分析发现，差异表达基因富集程度最大且富集最显著的GO分类均与微管和细胞骨架有关。微管是细胞骨架的重要组成部分，与细胞内物质运输、细胞运动及纺锤体组装、染色体分离等有丝分裂过程密切相关，微管的解聚与重组在整个细胞周期进程中起着重要作用[16-19]。通过微管抑制剂或RNAi技术降低微管蛋白基因表达量会使浮游植物细胞周期阻滞从而影响细胞分裂[20-22]。此外，一些微管蛋白可通过调节cyclin蛋白或Cdc蛋白直接参与细胞周期进程的控制，部分Cdc蛋白也可以调节微管动态变化[23-24]。因此，细胞中的微管动态变化不同可引起两实验组细胞周期进程的差异。
细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性激酶、细胞分裂控制蛋白相互作用共同调控细胞周期G1/S期的转变及G2/M期的转变[9,25]。CDK蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，有着多种保守顺序，包括PSTAIRE、PCTAIRE、PSTALRE等，其活性在整个细胞周期进程中动态变化[26-27]。CDK1与CYCB共同参与G2期到M期转变的调节[25,28]。本研究中，CDK1基因TRINITY_DN56240_c0_g1在第16组中表达稳定，且其相对表达量在接种后的3个时间点时均为第3组显著高于第16组(P<0.05)。然而，CDK1基因TRINITY_DN7569_ c3_g1在第16组则“先升后降”，且在10:00其相对表达量显著高于第3组，与CYCB基因的表达模式一致。由于第3组部分藻细胞阻滞在G2/M期，当细胞阻滞在G2期时，需要足够量的CDK活性来维持G2-specific基因的转录水平，如CYCA和CYCB等，待环境适宜时继续进行分裂[29]。因此，CDK1基因TRINITY_DN56240_c0_g1和TRINITY_ DN7569_c3_g1在细胞阻滞在G2/M期时均发挥功能，而当藻细胞由G2期向M期顺利转变时仅需后者发挥作用。
CYCA与CDK2能够形成复合体并在S期早期和G2期被激活[30]。东海原甲藻暴发时，CDK2蛋白在G2/M期表达量最低，而在G1后期和S期表达量较高[31]。此外，CYCU在细胞周期中的G1/S期发挥调控作用，CYCU/CDKA复合体能够促进DNA复制[32]。第3组藻细胞S期结束于10:00，而此时第16组仍有2.31%的藻细胞处于S期。因此，10:00 CYCA基因、CYCU基因和4个编码CDK2蛋白的基因相对转录量均为第16组显著高于第3组，它们在S期的延长中起到了重要作用。
Cdc48最初是从温度敏感型裂殖酵母中分离得到的，是AAA (ATPase associated with various cellular activities)超家族成员之一[33]。Cdc48参与DNA的复制和修复，对基因组稳定性和细胞活力至关重要[33]。Zhang等[31]在东海原甲藻中鉴定了Cdc48蛋白，其在S期表达量最高，与DNA复制密切相关。第16组中Cdc48基因表达量在10:00显著高于第3组，使得第16组细胞S期较第3组更长。
4 结论本研究利用流式细胞仪研究了不同增殖速度的东海原甲藻细胞周期的时相分布特点：增殖速度较慢的实验组的S期时长更短，且部分细胞会阻滞在G2/M期。结合细胞周期时相分布，通过转录组测序以及qRT-PCR技术验证发现了1个CYCB和2个CDK1基因与调节东海原甲藻G2/M期阻滞有关，1个CYCA、1个CYCU、4个CDK2和1个Cdc48基因与藻细胞的S期进程调控有关。本研究仅对10个通过转录组技术鉴定出的差异基因的表达量进行qRT-PCR验证，其他与细胞周期有关的基因仍需要进一步验证表达模式并进行后续的功能分析。
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