2025, Vol. 32 
大口黑鲈(Micropterus salmoides)，又称加州鲈，是我国重要的养殖鱼类，养殖规模与产量居高不下。然而，随着大口黑鲈养殖规模的不断攀升，大口黑鲈虹彩病毒(largemouth bass ranavirus, LMBV)的流行也愈演愈烈，并造成重大经济损失[1-2]。LMBV是隶属于虹彩病毒科、蛙虹彩病毒属的20面体双链DNA病毒，基因组99 kb左右[3]，最早在1991年美国佛罗里达州维尔湖发现[4]，我国于2009年报道了LMBV引起的疫情[5]。LMBV感染大口黑鲈引起体表溃疡、内脏肿大[6]，随病程发展，病毒在体内大量增殖，引发炎症因子风暴、炎性细胞浸润与组织损伤[7-9]，最终导致机体死亡。从中草药中筛选能够激活宿主天然免疫、抑制LMBV增殖与病毒诱导炎症的粗提物或单体在抗LMBV感染药物研究中展现出良好的应用前景。紫花地丁(Viola philippica)和黄连(Coptis chinensis Franch)醇提物[7]、刺五加(Acanthopanax senticosus)水提物[10]均表现出抗炎以及提高LMBV或MRV攻毒存活率的效果。白屈菜红碱(chelerythrine)[8]、EGCG (epigallocatechin-3-gallate)[11]、胡椒碱(piperine)[12]、小檗碱(berberine)[13]等中草药单体以及槲皮素(quercetin)等5种单体的混合物[14]也表现出抑制LMBV增殖、降低攻毒死亡率的生物活性。
大蓟(Cirsium japonicum)隶属于菊科蓟属，是多年生草本植物，在全国多地均有种植，被列入中国饲料原料目录以及《中国药典》，而且通过不同提取工艺获得的活性成分具有止血[15]、抗氧化[16]、抗炎[17-18]、抗病毒活性[19-20]的功效。大蓟水提物(Cirsium japonicum aqueous extract, CJAE)为大蓟的地上部分水煎提取的水提物干粉，含有黄酮、多糖等活性成分。杨星辰等[19]研究大蓟提取的黄酮类化合物——芹菜素(apigenin)、柳穿鱼苷(pectolinarin)、蒙花苷(linarin)等成分对B型肝炎(hepatitis B virus, HBV)的抑制活性，发现芹菜素与柳穿鱼苷具有明显抑制HBV在HepG细胞内复制的活性，大蓟中含量最多的黄酮类物质柳穿鱼苷可通过直接抑制3c样蛋白酶(3CLpro)发挥抗SARS-CoV-2作用[20-21]，表明大蓟提取物可以直接抑制病毒复制。进一步研究表明大蓟黄酮类化合物通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制炎症相关因子转录，从而调节炎症因子的分泌，发挥抗炎作用[22]。前期对LMBV的研究发现，LMBV引起鳜、鲈等淡水鱼大规模死亡，并表现为明显炎症[6,23]。本研究通过体内外实验评价CJAE抗LMBV效果，以期为抗LMBV药物的研发奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料鳜脑细胞系(Siniperca chuatsi brain cell 3, SCB3)由广东省农业科学院动物卫生研究所水产病害研究室建立并保存，以含10% FBS的L-15培养基25 ℃培养。LMBV由本研究室分离自广东省佛山市某大口黑鲈养殖场。实验用大口黑鲈[(15.0±2.0) g]购自广东省佛山市某大口黑鲈养殖场，经PCR检测排除LMBV[10]、ISKNV[24]、RSIV[25]、SCRV[25]感染。兔抗LMBV MCP多抗为本研究室制备[26]。大蓟水提物(CJAE) 10∶1，为大蓟地上部分水溶部分浓缩物，购自广东顺安丰泰水产科技有限公司。
1.2 CJAE对SCB3细胞毒性/安全性测定CJAE对SCB3细胞毒性/安全性测定采用CCK-8实验。参照文献[10]在96孔细胞培养板中培养SCB3细胞至单层，每孔加入100 μL L-15稀释的CJAE (终浓度分别为：2000 μg/mL、1500 μg/mL、1000 μg/mL、500 μg/mL与250 μg/mL)，设立未加药孔作为对照，孵育48 h后每孔加入20 μL CCK-8试剂，继续孵育4 h，测定OD450，根据下列公式计算CJAE对SCB3细胞的毒性/安全性。
细胞病变率(%)=(对照组OD450值−实验组OD450值)/对照组OD450值×100%
1.3 CJAE体外抗LMBV活性测定 1.3.1 SYBRgreen qPCR方法测定CJAE体外抗LMBV活性参照文献[10]在12孔板中培养SCB3细胞至单层，每孔加入LMBV稀释液(2 mL, 100 TCID50/mL)于25 ℃孵育1 h，弃掉上清液，PBS清洗3次。每孔加入2 mL L-15稀释的CJAE (终浓度分别为：1000 μg/mL、800 μg/mL、600 μg/mL、400 μg/mL与200 μg/mL), 25 ℃继续孵育48 h。随后，细胞培养板−80 ℃-室温反复冻融3次，上清液采用天隆病毒核酸提取试剂盒提取DNA作为模板，按照诺维赞ChamQ Universal SYBR qPCR试剂盒配制反应体系，进行SYBRgreen qPCR扩增，计算LMBV病毒拷贝数。感染LMBV后不给药(CJAE)的SCB3细胞培养物为阳性对照。根据下列公式计算CJAE对LMBV的抑制率。
| $抑制率\left( \% \right) = (1 - {\rm{A/B}}) \times 100\% $ |
式中，A为加入不同浓度CJAE后LMBV的拷贝数；B为阳性对照组LMBV的拷贝数。
1.3.2 间接免疫荧光法测定CJAE体外抗LMBV活性按5×105个/mL SCB3细胞接种至玻底共聚焦培养皿(25 mm), 25 ℃培养至单层后，弃掉培养液，加入LMBV细胞培养物(1 mL/孔，100 TCID50/mL)于25 ℃孵育1 h，弃掉上清液，PBS清洗3次后加入1000 µg/mL CJAE，于25 ℃继续分别培养48 h、72 h，去掉培养液，PBS润洗3次，参照文献[26]依次进行多聚甲醛固定20 min、0.1% Triton X100通透10 min、1% BSA封闭30 min、一抗(抗MCP多克隆抗体，1∶1000稀释) 4 ℃孵育过夜、荧光二抗(AF647标记羊抗兔单克隆抗体，1∶1000稀释) 37 ℃避光孵育1 h、1 mL DAPI稀释液(1∶1000稀释) 37 ℃避光孵育10 min，最后加入抗荧光猝灭剂至玻璃皿中心圈内，激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss LSM710)下观察。
1.4 CJAE在LMBV不同生命周期阶段的抗病毒效果比较 1.4.1 CJAE在病毒黏附阶段抗病毒效果测定参照Tao等[26], 48孔板培养细胞至单层后，以1000 µg/mL CJAE预处理细胞1 h，之后加入LMBV细胞毒上清，4 ℃条件下孵育1 h。PBS润洗3次后，换新鲜培养基，25 ℃继续培养48 h，收集细胞反复冻融3次提取总DNA，按
参照Tao等[26], 48孔板培养细胞至单层后，加入LMBV细胞毒上清，于4 ℃条件下孵育30 min。PBS润洗3次后，以1000 µg/mL CJAE 4 ℃继续孵育2 h，之后更换新鲜培养基，25 ℃继续孵育48 h后，收集细胞反复冻融3次后提取DNA，按
参照Tao等[26], 48孔板培养细胞至单层后，加入LMBV细胞毒上清，先于4 ℃条件下孵育30 min，再转移至25 ℃条件下孵育4 h，之后更换新鲜培养基，以1000 µg/mL CJAE 25 ℃继续孵育48 h，收集细胞反复冻融3次提取总DNA，按
实验大口黑鲈随机分为4组，每组100尾，养殖于实验网箱(60 cm×100 cm×70 cm)。分别称取5.0 g、10.0 g和15.0 g CJAE充分溶解于100 mL灭菌ddH2O，分别均匀喷洒至1000 g基础饲粮中，制备含有0.5%、1.0%、1.5% CJAE的饲料，充分晾干后分组饲喂，每日饱饲2次，对照组饲喂基础饲粮。连续饲喂15 d后，每组随机取40尾鱼，腹腔注射100 µL LMBV细胞培养物(1×107 TCID50/mL)，攻毒后转移至水族箱(40 cm×30 cm×40 cm)，连续曝气，水温维持在25~28 ℃。每天观察、记录实验鱼死亡情况，绘制生存曲线。剖解死亡大口黑鲈，取攻毒各实验组大口黑鲈肝脏、脾脏、肾脏、前肠、中肠和后肠组织以及攻毒20 d后存活的0.5% CJAE组、1.0% CJAE组与1.5% CJAE组大口黑鲈肝脏、脾脏、肾脏、前肠、中肠和后肠组织，提取组织DNA，按
参考Wang等[27]，以FITC标记的鯴鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)为颗粒抗原，测定CJAE对大口黑鲈头肾白细胞吞噬能力的影响。CJAE投喂15 d后，每组随机取5尾鱼，采用鱼组织白细胞分离液试剂盒(灏洋生物制品公司，天津)提取头肾组织白细胞并计数。2×106个/mL头肾白细胞与2×107 cfu/mL FITC标记的鯴鱼诺卡氏菌于25 ℃共孵育4 h后，1200 r/min离心30 min，弃掉上清液，沉淀细胞用PBS清洗3次后，随后以1 mL PBS彻底悬浮细胞，流式细胞术分析CJAE对大口黑鲈头肾白细胞吞噬能力的影响。
1.7 CJAE对大口黑鲈免疫相关基因mRNA表达变化的影响CJAE饲喂15 d后，每组随机取5尾鱼，采用组织RNA提取试剂盒(Vazyme，南京)分别提取脾脏、头肾组织RNA，反转录成cDNA (Vazyme，南京)。以Wu等[28]建立的免疫相关基因SYBR green qPCR方法，2−ΔΔCt法分析CJAE对大口黑鲈白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、IL-10、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、Fcγ受体Ia (Fcγ receptor Ia, FcγRIa)、FcγRIIb、酪氨酸激酶(tyrosine-protein kinase, Lyn)、肌动蛋白相关蛋白(actin related protein 2/3 complex, subunit 5, ARPC5)、肌动蛋白素(cofilin, CFL)、嗜中性粒细胞胞浆因子(neutrophil cytosolic factor 1, NCF1)基因mRNA表达变化的影响，引物序列如表1所示。
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表1 大口黑鲈免疫相关基因及其LMBV检测引物 Tab. 1 Primers for immune-related genes and LMBV detection genes of largemouth bass |
对CJAE在鳜脑细胞系上的安全浓度分析、LMBV拷贝数变化进行单因素方差分析(SPSS 23.0)。大口黑鲈免疫相关基因mRNA表达变化的影响利用SPSS 23.0软件进行独立样本t检验分析。生存曲线采用GraphPad prism version 8.0软件分析，并利用Log-rank (Mantel-Cox)进行显著性分析。P<0.05代表显著性差异，P<0.01代表极显著性差异。
2 结果与分析 2.1 CJAE在SCB3细胞系上的安全浓度采用CCK-8实验分析不同浓度CJAE对SCB3细胞的毒性，结果如图1所示，2000 μg/mL与1500 μg/mL CJAE孵育SCB3细胞48 h后显著降低了SCB3的细胞活力；而CJAE≤1000 µg/mL的各组之间以及与对照组之间的细胞活力均无显著性差异，因此本研究选择1000 µg/mL作为CJAE在SCB3细胞上的最大安全浓度值。采用GraphPad prism version 8.0计算CJAE的CC50值为1487.0 μg/mL。
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图1 CCK-8检测分析CJAE对SCB3细胞毒性分析结果与对照组相比，*差异显著(P<0.05). Fig. 1 Toxicity analysis result of CJAE on SCB3 cell through CCK8 detectionCompared with control group, * significant difference (P<0.05). |
CJAE体外抗LMBV活性测定分别采用SYBRgreen qPCR与IFA分析加药后病毒拷贝数差异与病毒MCP蛋白的胞内表达。结果如图2a所示，1000 µg/mL、800 μg/mL、600 μg/mL、400 μg/mL CJAE组LMBV的相对抑制率分别为98.79%、96.12%、87.52%、56.16%，均显著低于对照组(P<0.05)。随后对各组抑制率进行拟合分析，结果显示，CJAE对LMBV的抑制作用EC50值为457.3 µg/mL (图2b)。为了进一步验证药物的抗病毒效果，采用免疫荧光法检测了LMBV MCP蛋白的表达水平，结果显示，SCB3细胞添加CJAE (1000 µg/mL)明显降低了荧光强度(图3)，统计结果显示，CJAE添加极显著降低了荧光密度值，其中CJAE 48 h组相较于LMBV 48 h组荧光密度值降低了85.81%, CJAE 72 h组相较于LMBV 72 h组荧光密度值降低了75.82%，证明CJAE显著抑制了LMBV增殖。
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图2 CJAE抗LMBV抑制率与EC50值测定a. CJAE抗LMBV抑制率测定，与对照组比较分析显著性，*差异显著(P<0.05); b. CJAE对LMBV EC50值测定结果. Fig. 2 The determination of the inhibition rate of CJAE against LMBV and EC50 valuea. Inhibition rate detection of anti-LMBV of CJAE, * significant difference (P<0.05) compared with control group; b. EC50 value determination. |
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图3 CJAE抗LMBV MCP蛋白表达的影响a. 荧光强度；b. 相对荧光密度值差异，**差异极显著(P<0.01). Fig. 3 Effects of CJAE on the expression of LMBV MCP proteina. Fluorescence intensity; b. Differences in relative fluorescence intensity value, with ** indicating highly significant difference (P<0.01). |
本研究评价了在病毒黏附、入侵和复制阶段CJAE对LMBV病毒拷贝数的影响。结果表明在LMBV黏附阶段，CJAE不能降低LMBV拷贝数，但在入侵和复制阶段，CJAE显著降低了LMBV拷贝数，其中1000 µg/mL CJAE在入侵和复制阶段，LMBV拷贝数分别减少了98.46%和99.31% (图4)。
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图4 CJAE对LMBV不同生命周期抑制活性影响研究结果*表示与对照组比较差异显著(P<0.05), **表示差异极显著(P<0.01). Fig. 4 Effects of CJAE on different life cycle inhibition activities of LMBV* denotes significant difference compared with control group (P<0.05), ** denotes highly significant difference (P<0.01). |
分别以0.5%、1.0%和1.5% CJAE饲喂大口黑鲈15 d后，腹腔注射LMBV，每天记录死亡率并绘制生存曲线，结果如图5所示，CJAE可以提供35%~ 60%的攻毒保护率，0.5%、1.0%和1.5% CJAE组在攻毒后第3天开始出现死亡，至20 d死亡率分别为50%、40%和65%，而对照组自攻毒后第3天出现死亡后，至第6天全部死亡，统计学分析显示(Mantel-Cox)，给药组均与对照组存在极显著差异(P<0.01)。0.5%、1.0%与1.5% CJAE组的相对保护率(RPS)分别为50%、60%与35%。提取DNA测定LMBV拷贝数病毒载量，结果如图6所示，对照组攻毒6 d后全部死亡，各组织LMBV拷贝数在9.24×105~1.50×108 copies/mL之间；而0.5%、1.0%和1.5% CJAE组各组织LMBV拷贝数在7.49×102~8.14×105 copies/mL之间，相较于对照组，各组织病毒载量降低87.57%~99.99%。统计学分析显示，不同浓度的CJAE (0.5%、1.0%、1.5%)均可以极显著降低病毒载量(P<0.01)，与未给药的对照组相比，病毒载量最高可以降低99.99%，结果证明CJAE具有明显的体内抗LMBV活性。
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图5 CJAE抗LMBV存活率曲线分析 Fig. 5 Survival rate curve analysis of anti-LMBV effect of CJAE |
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图6 CJAE抗LMBV组织病毒含量分析结果*表示与对照组比较差异显著(P<0.05), **表示差异极显著(P<0.01). Fig. 6 Tissue virus load analysis of anti-LMBV effect of CJAE* denotes significant difference compared with control group (P<0.05), ** denotes highly significant difference (P<0.01). |
解剖LMBV感染死亡实验大口黑鲈，可见明显肠道炎症，肠腔充满脓液(图7a、7b)，随后取死亡大口黑鲈肠道制作组织切片并进行H&E染色分析，结果可见肠道结构弥散，大量炎性细胞浸润(图7c、7d)，取CJAE组攻毒后存活大口黑鲈制作组织切片进行H&E染色分析，结果可见肠道结构完整，相较于未攻毒大口黑鲈(图7g, 7h)，肠绒毛结构仅见少许断裂，未见大量炎性细胞(图7e, 7f)。
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图7 大口黑鲈肠道组织H&E染色a, b. LMBV攻毒死亡大口黑鲈肠道解剖图；c, d. LBMV攻毒死亡大口黑鲈肠道切片；e, f. CJAE组攻毒存活大口黑鲈肠道组织切片；g, h. 未攻毒大口黑鲈肠道组织切片. Fig. 7 H&E staining of intestinal tissue of largemouth bassa, b. Intestinal anatomical illustration of dead largemouth bass by LMBV infection; c, d. Intestinal slice of dead largemouth bass by LMBV infection; e, f. Intestinal slice of survival largemouth bass after CJAE feeding; g, h. Intestinal slice of unchallenged largemouth bass. |
吞噬活力测定是评价天然免疫水平的重要指标之一，本研究评价了CJAE添加对大口黑鲈白细胞吞噬能力的影响。如图8所示，0.5%、1.0%与1.5% CJAE组均提高了大口黑鲈白细胞对外来抗原的吞噬能力，吞噬率分别为51.6%、64.2%与39.3%；而对照组吞噬率仅为25.2%，吞噬活力上调35.88%~60.75%。由结果可见，1.0%的CJAE提升头肾白细胞吞噬活力的效果最为显著。
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图8 CJAE对大口黑鲈头肾白细胞吞噬流式分析结果 Fig. 8 Flow cytometry analysis of phagocytic effect of CJAE on leukocytes of largemouth bass head kidney |
鉴于1.0%的CJAE表现出最佳的攻毒保护效果与最高吞噬率，本研究进一步采用qPCR分析1.0% CJAE添加量对免疫相关基因mRNA表达水平的影响。如图9所示，在脾脏组织中，1.0% CJAE显著激活吞噬相关基因FcγRIa、Lyn、CFL与抗炎基因IL-10表达水平，并显著抑制促炎基因IL-1β和TNF-α的表达水平(P<0.05, P<0.01)；在头肾组织中，1.0% CJAE显著激活吞噬相关基因FcγRIa、Lyn、CFL、ARPC5与抗炎基因IL-10表达水平，并显著抑制促炎基因IL-1β和TNF-α的表达水平(P<0.05, P<0.01)。
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图9 CJAE对大口黑鲈组织免疫相关基因表达水平的影响a. 脾脏；b. 头肾. *表示与对照组比较差异显著(P<0.05), **表示差异极显著(P<0.01). Fig. 9 Effect of CJAE on immune-related gene expression in largemouth bass tissuesa. Spleen tissue; b. Head kidney tissue. * denotes significant difference compared with control group (P<0.05), ** denotes highly significant difference (P<0.01). |
中草药是我国传染医学的瑰宝，因其具有来源广、副作用低、多靶点及不易产生耐药性等特点，越来越多抗病药物的研发开始关注中草药提取物。近年来，中草药提取物在防治水生动物病毒感染中表现出优异的效果，成为抗病毒药物筛选的重要目标。在抗LMBV感染研究中，李秋语等[7]评价了29种中草药粗提物(醇提物)的体外抗LMBV效果，其中紫花地丁和黄连表现出优异的抗LMBV效果，进一步体内实验表明，两种粗提物可以提供40%的攻毒保护率，体内用药后病毒在肝组织的抑制率分别可达71.5%和67.0%；刺五加水提物抗LMBV/MRV的研究显示，刺五加水提物表现出显著的体内外抗LMBV效果，可以提供30.48%的攻毒保护率[10]；牛晨[8]评价了白屈菜红碱的抗LMBV活性，白屈菜红碱对感染LMBV的EPC细胞的保护率为21%~24%，体内抗LMBV实验表明白屈菜红碱对大口黑鲈的保护率高达40%。本研究在CJAE体外抗LMBV活性研究基础上，评价CJAE作为饲料添加剂抗LMBV效果，结果显示CJAE显著提高了大口黑鲈对LMBV的相对保护率(1.0%添加量RPS最高60%)，且病毒载量分析结果显示，CJAE显著降低LMBV靶器官肝、脾、肾、前肠、中肠、后肠的病毒含量，发挥了体内抑制LMBV增殖的效果，证明CJAE具有更优异的抗LMBV效果，可以在水产养殖中作为饲料添加剂预防LMBV的感染，1.0%添加量效果最佳，具有剂量依赖性。
中草药提取物作为水产饲料添加剂在发挥免疫调节[29]与提高生长性能[30-31]方面已获得广泛应用。但鱼类抗病毒药物研究多采用浸泡给药[31]或腹腔注射[14,32-33], Haetrakul等[32]用浸泡给药方式证实鳄嘴花粗提物(Clinacanthus nutans)对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV3)的抑制活性，Yu等[33]通过注射给药方式证实了紫花地丁水提物对石斑鱼虹彩病毒(grouper iridovirus, GIV)的抑制活性，Niu等[14]在体外实验评价20种中草药提取物(单体)抑制LMBV活性的基础上，通过注射给药方式证实了两种单体混合物对LMBV体内抑制活性，可能通过激活大口黑鲈I型和III型干扰素通路发挥抗病毒活性。但鉴于鱼类养殖特征，饲喂(口服)是最理想的给药方式，越来越多的研究也表明饲喂给药方式的有效性。Li等[34]用饲喂给药方式证实了柴胡皂苷(saikosaponin)的抗LMBV活性，Xue等[35]用饲喂给药方式证实了七叶苷(esculin)对LMBV的体内抑制活性，本研究采用饲粮添加方式，研究CJAE对LMBV的抑制活性，更具有生产意义。综上所述，本研究通过体内外实验证明CJAE可以直接抑制LMBV的增殖，发挥抗LMBV活性。
3.2 CJAE通过提高大口黑鲈头肾白细胞吞噬活力发挥抗LMBV活性中草药因其多作用靶点、系统性的特点为揭示其作用机制增加了困难。抗病毒药物的作用机制分为直接抗病毒作用与间接抗病毒作用。直接抗病毒作用表现为药物直接杀灭病毒、阻止病毒吸附、入侵或抑制病毒在体内转录与复制。间接抗病毒作用表现为药物激活机体免疫系统[36-37]、参与机体/细胞炎症调节[38]、或抗氧化[39]等。鱼类先天性免疫被认为在帮助机体清除病毒、细菌、寄生虫等病原体发挥重要作用，复杂的天然免疫网络、大量先天性免疫细胞及非特异性免疫因子为鱼类提供最为重要的免疫屏障，发挥重要的间接抗病毒作用。吞噬(Phagocytosis)是机体天然免疫中一种重要防御机制，是评价大口黑鲈天然免疫的重要指标之一[40-41]。病原体入侵机体，吞噬细胞吞噬受体与病原体结合，继而被吞噬细胞吞噬，激活酪氨酸激酶家族蛋白，启动信号转导，发生抗原内化和病原体降解，并将病原体加工成具有抗原决定簇的肽段，完成抗原递呈与免疫应答[42]，是机体免疫系统最为重要的激活机制。本研究通过体内、体外实验，证实了CJAE的直接抗病毒作用，采用吞噬率评价CJAE对大口黑鲈天然免疫的影响，进一步qPCR方法验证了CJAE对大口黑鲈吞噬相关基因的表达调控。结果发现CJAE饲喂后，显著提高大口黑鲈头肾白细胞的吞噬能力，激活Fc受体介导的吞噬通路关键基因——FcγRIa、Lyn、CFL、ARPC5的表达，推测CJAE可能通过激活Fc受体介导的吞噬通路发挥免疫调节作用。对刺五加水提物抗病毒研究表明，刺五加水提物提高了大口黑鲈白细胞对抗原的吞噬活性(吞噬率：80.9%)[10]，与此一致，CJAE也显著提高了大口黑鲈的吞噬率(吞噬率：64.2%)，推测CJAE通过调控吞噬细胞吞噬作用激活大口黑鲈天然免疫，发挥间接抗LMBV作用，可能还存在其他抗LMBV机制。
3.3 CJAE通过减轻LMBV感染引起的大口黑鲈肠道损伤发挥抗LMBV活性抑制病毒引起的组织炎症损伤是抗病毒药物评价的关键指标，也是药物能否控制病毒感染成功与否的关键。前期研究证明，炎症是LMBV的重要致病机制[6,8]。LMBV感染大口黑鲈引起体表溃疡、内脏肿大[5]，随病程发展，组织病毒载量逐渐增加，发生炎性细胞浸润，引发多组织炎症反应最终导致机体死亡[6,8]。Gao等[23]研究发现LMBV/MRV感染引起明显的肠道炎症，前、中和后肠组织炎症细胞大量浸润。大蓟具有优异的抗炎功效，前期研究显示在LPS诱导的RAW 264.7细胞、PC12细胞和小鼠炎症模型中，大蓟提取物显著下调IL-1β、TNF-α和iNOS等促炎细胞因子的表达[18,43]。在本研究中笔者发现投喂CJAE明显减轻肠道组织损伤与炎性细胞浸润，进一步采用qPCR方法验证了CJAE对大口黑鲈炎症相关因子的调控，结果显示CJAE显著降低大口黑鲈关键促炎细胞因子(TNF-α与IL-1β)的表达，并显著提高抗炎细胞因子(IL-10)的表达，证明CJAE可能通过抗炎作用发挥抗病毒活性。前期牛晨[8]研究发现，白屈菜红碱能有效抑制LMBV感染造成的组织器官炎性细胞浸润与组织炎症损伤，揭示白屈菜红碱通过抑制LMBV相关的炎症损伤，发挥抗LMBV活性，与笔者的研究结果一致。但CJAE究竟通过何种信号通路发挥抗炎活性，值得进一步深入研究。
4 结论综上所述，CJAE具有显著的体内、体外抗LMBV活性；直接抗LMBV活性表现为CJAE抑制LMBV在SCB3细胞中的增殖与大口黑鲈组织病毒载量；间接抗LMBV活性表现为CJAE提高大口黑鲈吞噬细胞吞噬活性与改善LMBV感染造成的大口黑鲈组织炎症；进一步研究发现，CJAE最佳添加量为1.0%。本研究为生产中采用CJAE预防LMBV感染以及进一步分析CJAE中的抗LMBV活性成分提供了基础。
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