2025, Vol. 32 
2. 上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306
2. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Germplasm Resources, Ministry of Agriculture and Rural Affars; Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
珍珠贝的贝壳和珍珠都是生物矿化的产物，其进程受到多种因素的影响[1]。三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是重要的淡水珍珠贝之一，其生产的珍珠占世界淡水珍珠产量的95%以上[2]。珍珠培育是由两只珍珠蚌相互作用而产生，将供体蚌的外套膜组织切成小片，移植到受体育珠蚌的外套膜中，插入的外套膜小片逐渐分裂分化，形成珍珠囊，并在外套膜插核部位不断分泌珍珠质形成珍珠[3]，其生物学机理是由外源刺激引起的免疫防御反应调控的生物矿化过程[4]。贝类血淋巴细胞在免疫防御中起着重要的作用，并参与珍珠贝插核育珠进程[5]。研究发现贝类血淋巴细胞中含有大量免疫相关蛋白，且部分与贝类的生物矿化反应相关，如C型凝集素[6]、Kunitz蛋白酶抑制剂[7]等，由此推测血淋巴细胞能够参与生物矿化过程。
目前已使用多种技术研究了贝类血淋巴细胞的形态和分类，包括光学显微镜、电子显微镜和流式细胞术[8-9]等。尽管对血淋巴细胞分类还存在争议，但在贝类中通常根据细胞质是否存在颗粒来区分两种主要的血淋巴细胞类型——粒细胞和透明细胞[10-11]。双壳类血淋巴细胞除了在宿主防御中发挥作用，还执行各种重要的生理功能，包括营养运输分配、伤口愈合和排泄等[12-13]。对贝类血淋巴细胞形态与功能展开研究，能够为深入了解血淋巴细胞的生物矿化功能提供理论基础。
近来的研究表明血淋巴细胞可能参与贝类贝壳的生物矿化过程。欧洲鲍(Haliotis tuberculata)的血淋巴细胞中合成了Ca2+阳性颗粒内容物，参与了贝壳的修复和再生过程[14]。此外，诱导壳再生修复的研究发现颗粒细胞中含有CaCO3晶体且相较其他类型血淋巴细胞的丰度增加，说明了颗粒细胞具有潜在CaCO3合成与运输功能[15]。同时，Huang等[16]发现在合浦珠母贝壳损伤刺激后的再生过程中，血淋巴细胞内Ca2+代谢相关基因碳酸酐酶、钙调蛋白-2和钙调蛋白-3显著上调。Ivanina等[17]发现在牡蛎中与壳形成相关的酪蛋白激酶I和酪蛋白激酶II等基因在H2和H3血淋巴细胞(类似于粒细胞)中高度表达，表明血淋巴细胞是贝壳矿化过程中的潜在参与者。
目前，已有一些研究发现血淋巴细胞可能参与珍珠矿化，Kishore等[18]发现血淋巴细胞的过度积累会造成珍珠囊内凸起，从而形成形状不规则的珍珠，Shen等[19]在珍珠囊腔中发现血淋巴细胞分泌有机基质覆盖在血淋巴细胞凝块上，和囊泡构成珍珠的核心，推测血淋巴细胞在珍珠形成过程中起到复杂而必要的作用，但其机制尚不清楚。本研究为探索三角帆蚌血淋巴细胞对插核刺激的响应与矿化功能，对血淋巴细胞进行分类，评估了插核刺激对血淋巴细胞数量和分布情况的影响，测定血淋巴细胞和血清中钙含量，并且通过体外CaCO3结晶实验证明血淋巴细胞和血清参与晶体的形成过程，旨为进一步解析三角帆蚌血淋巴细胞参与珍珠矿化的机制提供研究基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物与样本采集实验用三角帆蚌购自浙江诸暨市淡水珍珠养殖基地，随机选取60只同批次繁育、健康、大小均一且体型完整的1龄三角帆蚌，长为(4.81±0.63) cm，宽为(1.09±0.02) cm，高为(2.98±0.14) cm；体重为(18.03±0.84) g，置于40 cm×26 cm×25 cm的水族箱暂养，每日投喂小球藻两次并持续供氧，实验期间养殖条件一致。
采用有核珍珠培育的方法进行插核育珠[20]，以未插核蚌为对照组(Con组)，插核后2 d (H-2组)，5 d (H-5组)，10 d (H-10组)，20 d (H-20组)和50 d (H-50组)的三角帆蚌为实验组，每组随机选取6只蚌，并在闭壳肌处用注射器采集血淋巴样本，新鲜样本立即进行实验，其中血淋巴细胞通过血淋巴样本离心后获得。随后采用断裂闭壳肌方法处死实验动物，采集对应插核组织部位样本，置于4%多聚甲醛固定，保存于4 ℃冰箱，用于后续实验。实验过程中操作人员严格遵守实验动物伦理规范，并按照上海海洋大学动物伦理委员会制定的规章制度执行。
1.2 血淋巴细胞形态观察显微观察：向采集到的新鲜血淋巴样本中加入等体积的4%多聚甲醛，转移至1.5 mL离心管并震荡使其充分混匀，将血淋巴混合液制成血涂片，室温干燥，甲醇固定3~5 min，使用改良吉姆萨染色液(碧云天，上海)染色25 min，流水冲洗，自然干燥后于光学显微镜下进行观察拍照。每张血涂片随机选择50个视野，鉴定血淋巴细胞类型并计算各类血淋巴细胞比例及核质比。
超微观察：将血淋巴细胞用2.5%戊二醛固定后，0.1 mol/L PBS (pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。然后在1%锇酸溶液室温固定5 h，0.1M PBS (pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。脱水，渗透后，将样品插入包埋板中37 ℃烤箱过夜，60 ℃烤箱聚合48 h。使用Leica UC7超薄切片机切片，厚度为60 nm。切片用铀铅双染色，室温干燥过夜，透射电子显微镜(TEM，hitachi HT7700)下观察，并采集图像进行分析。
1.3 流式细胞术分析向采集到的新鲜血淋巴样本中加入4%多聚甲醛，经200目筛网过滤后使用流式细胞仪(BD LSRFortessa)进行流式细胞分析，以前向散射(FSC)为横坐标，侧向散射(SSC)为纵坐标做散点图和等高图，根据不同类型细胞在FSC和SSC上的差异，分析各类血淋巴细胞占比的变化趋势。
1.4 组织染色与观察取以上4%多聚甲醛固定的插核组织样品，采用组织石蜡切片技术进行石蜡切片的制作[21]，切片厚度4 μm，使用苏木精和伊红(索莱宝，北京)对切片进行染色并封片，使用正置显微镜(Nikon Eclipse Ci-L)进行样本观察。
1.5 Ca2+含量测定血淋巴样本经3000 r/min离心后，获得血淋巴细胞与血清，使用钙含量显色检测试剂盒(碧云天，上海)测定血淋巴细胞与血清中的Ca2+含量。
1.6 体外CaCO3结晶饱和Ca(HCO3)2溶液制备：向50 mL超纯水中加入0.5 g CaCO3，向溶液中持续通入CO2，同时不断使用磁力搅拌机进行搅拌，6 h之后，用孔径为0.22 μm滤膜将溶液中多余CaCO3沉淀除去。
血淋巴细胞实验组：将血淋巴细胞与饱和Ca(HCO3)2溶液混匀；血淋巴细胞对照组：饱和Ca(HCO3)2溶液。血清实验组：向120 μL饱和Ca(HCO3)2溶液中加入20 μL血清并混匀；血清对照组：向120 μL饱和Ca(HCO3)2溶液中加入20 μL超纯水并混匀。
每组滴加20 μL混合液至硅化盖玻片上，将其置于六孔板凹槽中，体外CaCO3结晶实验将在这些盖玻片上进行。将六孔板置于培养箱中培养，过程中使用光学显微镜观察，培养6 h后，用超纯水洗去表面溶液，干燥后用扫描电镜(蔡司Sigma300)观察和拉曼光谱(雷尼绍inVia Qontor)分析。
1.7 数据统计与分析数据采用平均值±标准差($\bar x \pm {\rm{SD}}$)表示，采用SPSS 17.0数据软件进行统计分析，使用单因素方差分析(one-way ANOVA)及Duncan法进行多重比较，P<0.05时表示差异显著，采用GraphPad Prism 8.0和Origin 2018进行作图。
2 结果与分析 2.1 血淋巴细胞分类及插核后各亚群比例变化三角帆蚌血淋巴细胞经吉姆萨染液染色如图1所示，呈现出4种具有不同大小和形态的细胞群，分别为大颗粒细胞、小颗粒细胞、透明细胞和淋巴样细胞。4种类型血淋巴细胞直径、核直径和核质比的测定和计算结果见表1。大颗粒细胞体积较大，呈椭圆形，核质比低，细胞核偏心且呈圆形。细胞质内含有大量小颗粒。小颗粒细胞呈圆形或椭圆形，细胞核偏心分布，细胞内颗粒覆盖细胞核，且染色较深。透明细胞的核较大且偏离核心，细胞质透明，染色较浅，几乎不含颗粒，有少量伪足存在。淋巴样细胞为数量最少的细胞类型，体积较小，呈圆形，其细胞核染色较深，核质比大，且无颗粒。
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图1 三角帆蚌血淋巴细胞光学显微镜观察a. 大颗粒细胞；b. 小颗粒细胞；c. 透明细胞；d. 淋巴样细胞. Fig. 1 Optical microscopic observation of hemolymphocytes of Hyriopsis cumingiia. Large granulocyte; b. Small granulocyte; c. Hyalinocyte; d. Lymphoidocyte. |
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表1 三角帆蚌不同血淋巴细胞亚群的细胞特征分析 Tab. 1 Analysis of cell characteristics of different hemolymphocyte subpopulations in Hyriopsis cumingii |
通过TEM对细胞器和细胞内容物的观察结果如图2所示，三角帆蚌血淋巴细胞也可分为上述4类。大颗粒细胞体积较大，细胞核相对较小，胞质内含有大量的颗粒状物质，以及线粒体和高尔基体等细胞器，该类细胞的形状不规则，表面具有多处突起。小颗粒细胞的细胞核较大，胞浆结构紧密，包含大量的电子致密颗粒和电子透亮颗粒，且胞质中可见多种细胞器。透明细胞具有丝状伪足，细胞核较大，但细胞质内细胞器相对稀少，仅观察到少量的线粒体和内质网。淋巴样细胞体积较小，核质比高，细胞表面具有较短的丝状伪足，在胞质中仅有少量的线粒体。
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图2 三角帆蚌血淋巴细胞透射电子显微镜观察a. 大颗粒细胞；b. 小颗粒细胞；c. 透明细胞；d. 淋巴样细胞. N：细胞核；MI：线粒体；ER：内质网；F：丝状伪足；EDG：电子致密颗粒；ELG：电子透亮颗粒. Fig. 2 Transmission electron micrographs observation of hemolymphocytes in Hyriopsis cumingiia. Large granulocyte; b. Small granulocyte; c. Hyalinocyte; d. Lymphoidocyte. N: nucleus; MI: mitochondria; ER: endoplasmic reticulum; F: filopodia; EDG: electron-dense granule; ELG: electron-lucent granule. |
各细胞亚群比例变化情况如图3所示。在血淋巴细胞组成上，淋巴样细胞占比最少，为5.66%；颗粒细胞占比最高，为62.48%(其中大颗粒细胞为25.95%，小颗粒细胞为36.53%)；透明细胞占比为31.85%。插核刺激后，除淋巴样细胞外，其他血淋巴细胞亚群比例均发生显著变化。具体来看，透明细胞比例在插核刺激后显著下降(P<0.05)，H-50组透明细胞比例由Con组的31.85%显著降低到了16.33% (P<0.05)。大颗粒细胞比例逐渐上升，H-50组显著高于其他处理组(P<0.05)，为47.83%。小颗粒细胞比例先上升后下降，H-5组细胞比例达到最高值为39.48%，随后逐渐降低，H-50组的比例最低为30.95%。淋巴样细胞比例在插核刺激后没有显著差异。
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图3 三角帆蚌插核处理后血淋巴细胞亚群比例变化Con：未插核蚌对照组，H-2，H-5，H-10，H-20和H-50分别为插核后2 d，5 d，10 d，20 d和50 d实验组. Fig. 3 The variation of hemolymphocyte subpopulation ratio in Hyriopsis cumingii after nucleus insertionCon: control group without nucleus insertion; H-2, H-5, H-10, H-20 and H-50 indicate trial groups after nucleus insertion for 2 d, 5 d, 10 d, 20 d and 50 d, respectively. |
流式细胞术分析结果如图4所示。FSC反映了细胞的大小，SSC反映了细胞的复杂性和颗粒度。结果显示插核后三角帆蚌血淋巴细胞大小和颗粒度发生了显著变化。在散点图中发现，与Con组相比，插核刺激后血淋巴细胞大小和颗粒度分布更加集中，等高图显示插核刺激后血淋巴细胞的颗粒度和复杂性不断增加，且细胞直径逐渐增大，此外，由图5可见，插核刺激后颗粒细胞的数量显著增加，透明细胞数量显著降低。
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图4 三角帆蚌血淋巴细胞流式分析散点图和等高线图a−c分别为未插核组，H-2组和H-5组的散点图；d−f分别为a−c的等高图，g−i分别为H-10组，H-20组和H-50组的散点图；j−l分别为g−i的等高图. Fig. 4 Scatter plot and contour map of hemolymphocytes in Hyriopsis cumingii by flow analysisa−c are the scatter plot of control, H-2, H-5; d−f are the contour map of a−c; g−i are the scatter plot of H-10, H-20, H-50; j−l are the contour map of g−i. |
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图5 流式细胞术分析插核后血淋巴细胞亚群比例变化Con：未插核蚌对照组，H-2，H-5，H-10，H-20和H-50分别为插核后2 d，5 d，10 d，20 d和50 d实验组. Fig. 5 Flow analysis of the variation of hemolymphocyte subpopulation ratio after nucleus insertionCon: control group without nucleus insertion; H-2, H-5, H-10, H-20 and H-50 indicate trial groups after nucleus insertion for 2 d, 5 d, 10 d, 20 d and 50 d, respectively. |
外套膜组织切片HE染色结果如图6所示。Con组血淋巴细胞主要分布在结缔组织，组织间存在少量肌纤维，与Con组相比，插核刺激后各组插核部位附近血淋巴细胞数量呈现增加的趋势，其中颗粒细胞数量明显增加并在插核部位被招募。H-2组和H-5组尚未形成珍珠囊，但在切口处观察到大量血淋巴细胞存在。H-10组的插核部位已清晰可见部分扁平细胞，并伴随组织增生现象，其周围有大量血淋巴细胞聚集。H-20组游离的血淋巴细胞在珍珠囊附近更为集中，与周围结缔组织相比分布更密集，且肌纤维在珍珠囊周围大量分布。H-50组血淋巴细胞主要聚集在珍珠囊附近的结缔组织中。
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图6 三角帆蚌插核组织部位血淋巴细胞分布a-f分别为Con组，H-2组，H-5组，H-10组，H-20组和H-50组插核部位的高倍放大图，右上角黑色方框为概览图. H：血淋巴细胞；SM：平滑肌细胞；CT：结缔组织；E：上皮组织；FL：扁平细胞；黑色三角形为插核位置. Fig. 6 Distribution of hemolymphocytes in the nucleus insertion site of Hyriopsis cumingiia-f are higher magnification views of insertion site of Con, H-2, H-5, H-10, H-20 and H-50 respectively. The black boxes on the upper right corner are the overviews. H: hemolymphocytes; SM: smooth muscle; CT: connective tissue; E: epithelium; FL: flat cell; The black triangle is the insertion position. |
如图7所示，插核刺激后血淋巴细胞中的Ca2+含量先上升后下降，与Con组相比，H-2组和H-5组Ca2+含量显著上升(P<0.05)，H-10组达到最高值，随后显著下降(P<0.05)，H-50组达到最低点。血清中Ca2+含量与血淋巴细胞具有类似的趋势，Ca2+含量先上升后下降，H-10组达到最高值，并且显著高于其他时间点，随后Ca2+含量显著下降(P<0.05)。
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图7 插核处理对三角帆蚌血淋巴细胞和血清Ca2+含量的影响a. 血淋巴细胞Ca2+含量；b. 血清Ca2+含量；不同字母表示各组间存在显著性差异(P<0.05). Fig. 7 Effect of nucleus insertion on Ca2+ content of hemolymphocytes and serum of Hyriopsis cumingiia. Ca2+ content of hemolymphocytes; b. Ca2+ content of serum. Values with different letters are significantly different (P<0.05). |
血淋巴细胞体外结晶结果如图8所示，通过光学显微镜观察可见(图8a，8d)，血淋巴细胞在实验过程中保持形态结构完整，同时显著改变了方解石的形貌。扫描电镜结果显示，对照组中沉积的晶体为单个形状规则的六面体(图8b，8c)，而加入血淋巴细胞后(图8e，8f)，表现为侧边的向内收缩，晶体表面出现粗糙结构，呈现由多个方解石小晶体结合而成的晶貌。拉曼光谱的结果显示所有组别的晶体均为方解石晶体(图8g，8h)。综合上述实验结果，推测血淋巴细胞能够参与方解石晶体的生长过程，对晶体的形貌有调控作用，但未改变晶体晶型。
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图8 血淋巴细胞对方解石结晶的影响a. 光学显微镜观察对照组晶体；b. 对照组晶体的SEM图；c为b的放大图；d. 光学显微镜观察对照组晶体；e. 对照组晶体的SEM图；f为e的放大图；g. 对照组Raman光谱图；h. 实验组Raman光谱图. Fig. 8 Effect of hemolymphocytes on calcite crystallizationa. Optical microscopic observation of the control group crystals; b. SEM image of the control group crystals; c. The magnification view of b; d. Optical microscopic observation of the control group crystals; e. SEM image of the control group crystals; f. The magnification view of e; g. Raman spectra of the control group; h. Raman spectra of the experimental group. |
血清体外结晶结果如图9所示，对照组晶体的形貌为正常的平行六面体形状(图9b，9c)。加入血清后晶体明显增大，一些晶体面还出现凹槽样缺陷，表面粗糙，视野中的方解石晶体生长像是多个晶体结合在一起(图9e，9f)。拉曼光谱的结果显示所有组别的晶体均为方解石晶体(图9g，9h)。综合上述实验结果，推测血清能够参与方解石晶体的生长过程，对晶体的形貌产生影响，但未改变晶体晶型。
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图9 血清对方解石结晶的影响a. 光学显微镜观察对照组晶体；b. 对照组晶体的SEM图；c为b的放大图；d. 光学显微镜观察对照组晶体；e. 对照组晶体的SEM图；f为e的放大图；g. 对照组Raman光谱图；h. 实验组Raman光谱图. Fig. 9 Effect of serum on calcite crystallizationa. Optical microscopic observation of the control group crystals; b. SEM image of the control group crystals; c. The magnification view of b; d. Optical microscopic observation of the control group crystals; e. SEM image of the control group crystals; f. The magnification views of e; g. Raman spectra of the control group; h. Raman spectra of the experimental group. |
贝类血淋巴细胞的分类方式因人而异，特别是不同贝类的血淋巴细胞在形态上存在较大差异，贝类血淋巴细胞分类还没有一个统一标准[22]。目前大多数研究将双壳贝类的血淋巴细胞分为颗粒细胞和透明细胞两种类型，并在此基础上进行细化分类[23-24]。本研究中，通过对三角帆蚌血淋巴细胞的形态学和超微结构观察，发现除何秀娟等[25]报道的颗粒细胞和透明细胞外，还根据细胞内颗粒大小，将颗粒细胞进一步分为大颗粒细胞，小颗粒细胞；根据细胞大小和核质比，将透明细胞分为透明细胞和淋巴样细胞。该分类与褶纹冠蚌(Cristaria plicata)[26]和橄榄蛏蚌(Solenaia oleivora)[27]的血淋巴细胞分类一致。此外，在部分贝类中还发现了其他类型血淋巴细胞，石安静等[28]在椭圆背角无齿蚌(Anodonta woodiana)中发现了无颗粒细胞和类淋巴细胞；郭磊等[29]在池蝶蚌(Hyriopsis schlegeli)中发现了浆液细胞、类淋巴细胞、梭形细胞和血栓细胞，其中梭形细胞和血栓细胞被认为是透明细胞行使不同功能时的形态变化，而浆液细胞与颗粒细胞具有相似的特征。Freire等[30]在牡蛎(Crassostrea gasar)中发现了母细胞样细胞和浆液性血淋巴细胞，Li等[31]在合浦珠母贝(Pinctada fucata)中将透明细胞进一步细分为小透明细胞和大透明细胞。贝类血淋巴细胞的分类受到细胞形状、大小、内部结构、功能及外在条件变化等多种因素的影响[32]，因此不同种类的贝类血淋巴细胞类型存在一定差异。三角帆蚌血淋巴细胞的超微结构观察发现颗粒细胞中含有大量颗粒物质、线粒体和高尔基体等细胞器，而透明细胞中仅含有少量细胞器，这表明颗粒细胞相较透明细胞具有更丰富的功能。
3.2 三角帆蚌血淋巴细胞对插核刺激的响应本研究发现，三角帆蚌在插核刺激后其血淋巴细胞组分比例发生显著变化，其中颗粒细胞数量显著增加，透明细胞数量显著减少，这与何秀娟等[25]报道的三角帆蚌在内脏团插核育珠后血淋巴细胞的反应结果一致。此外，在插核组织部位观察到大量血淋巴细胞聚集，颗粒细胞被大量招募，有研究表明，透明细胞主要参与营养吸收、消化、运输和携氧等功能[33]；颗粒细胞在橄榄蛏蚌(Solenaia oleivora)[27]、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)[34]和合浦珠母贝(Pinctada fucata)[16]中已被证明具有吞噬功能。因此，三角帆蚌颗粒细胞比例显著增加可能与插核刺激后引起的组织损伤和炎症反应有关。贝类中不同的血淋巴细胞亚群可能差异性地执行了特定的生物学和生理学功能，其组成比例可在一定程度上反映机体的生理和免疫状态[9]。例如，张冬冬等[35]发现栉孔扇贝在11 ℃水温养殖时，颗粒细胞比例显著上升。龚秀琼等[36]研究指出菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)在全氟辛酸暴露后，透明细胞的比例显著增加，而颗粒细胞的比例显著减少；Kadar等[37]的研究发现深海喷口贻贝(Bathymodiolus azoricus)贝壳损伤后，血淋巴细胞向外套膜边缘的外叶迁移，在损伤部位大量聚集。余燕萍等[38]在圆背角无齿蚌(Anodonta woodia pacifica)珍珠囊伤口修复过程中发现颗粒细胞发挥着重要作用，说明颗粒细胞在插核刺激后的免疫反应中具有关键作用，担负着主要的免疫功能。不仅如此，Johnstone等[39]的研究发现，血淋巴细胞能够通过浸润金属圆盘表面在表面形成聚集体，并分泌细胞外基质以参与东部牡蛎(Crassostrea virginica)植入金属圆盘后的矿化过程[15,40]。在海水贝类中，已有文献指出颗粒细胞可能参与贝类的生物矿化过程，因此在插核刺激后期颗粒细胞的比例显著上升，可能与其参与珍珠的矿化过程密切相关。
3.3 三角帆蚌血淋巴细胞矿化功能分析贝类血淋巴细胞参与生物矿化的研究鲜有报道，现有研究主要集中于海水贝类，而针对淡水贝类血淋巴细胞的矿化功能的研究较为匮乏。有研究表明，海水贝类血淋巴细胞能够参与免疫反应和Ca2+释放。王文琪等[41]的研究发现，菲律宾蛤仔血淋巴细胞具有吞噬能力，可以参与炎症和损伤部位的修复；悉尼岩牡蛎(Saccostrea glomerata)的血淋巴细胞则能够通过包囊，来隔离过大的病原体[42]。此外，Huang等[16]研究表明合浦珠母贝(Pinctada fucata)血淋巴细胞在壳再生过程中，上调了钙代谢的基因，并在颗粒细胞中发现富含钙的囊泡；深海喷口贻贝(Bathymodiolus azoricus)的颗粒细胞同样能够在创伤修复中迁移到创伤部位并释放含钙的颗粒物质[43]。
本研究发现，在插核刺激后三角帆蚌血淋巴细胞和血清中Ca2+含量在早期显著上升，而后期显著下降。Ca2+作为一种重要的第二信使，在诸多生命过程中发挥着重要作用，胞内Ca2+浓度能够调节细胞的代谢、增殖、分化等环节，也与自身免疫病、炎症反应等有直接关系[44]。Ca2+浓度的上升会激活蛋白酶K[45]及JNK信号通路[46]，贾志浩等[47]指出，血淋巴细胞中较高水平的钙离子参与维持其吞噬及溶酶体的活性，从而参与免疫调节反应。马氏珠母贝(Pinctada martensi)在贝壳损伤后，血淋巴细胞内Ca2+含量显著上调，同时刺激血淋巴细胞的免疫系统活性[48]。因此认为，插核刺激引起了三角帆蚌血淋巴细胞Ca2+含量显著变化，从而可能引发了免疫响应。
珍珠主要由95%的CaCO3和5%的有机基质组成[49]，Ca2+的供应是CaCO3沉淀过程中一个重要的制约因素，珍珠通过贝类的钙代谢，以碳酸钙结晶的形式逐步沉积而成[50]，且Ca2+对珍珠质沉积具有促进作用[51]。在太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)贝壳损伤后发现其总血浆Ca2+含量增加[52]，合浦珠母贝(Pinctada fucata)贝壳损伤后，血淋巴细胞大量表达钙离子吸收和转运相关的基因，从而加速贝壳再生[53]，本研究发现，插核刺激显著增强了三角帆蚌血淋巴细胞Ca2+转运能力，为碳酸钙晶体形成提供物质基础。
体外CaCO3结晶实验能够清楚地观察物质对于晶体形貌或者晶型上的改变，是探究物质是否参与生物矿化的常用方法。本研究通过扫描电镜观察发现，血淋巴细胞改变了方解石晶体形貌，同时，结合光镜可以发现血淋巴细胞在实验过程中维持着完整的细胞形态，且细胞内结构保持良好，并未发生破裂现象，由此推测血淋巴细胞可能通过分泌胞外分泌物来影响方解石的形貌。在Kong等[54]的研究中发现外套膜细胞的细胞分泌物能改变天然方解石晶体的形貌，并促进晶体的生长及融合，说明了血淋巴细胞直接参与三角帆蚌的生物矿化，这为贝类生物矿化进程提供了新的见解。
4 结论本研究对三角帆蚌血淋巴细胞进行分类，并探究血淋巴细胞对插核刺激的响应及在矿化中的作用。结果表明三角帆蚌血淋巴细胞主要分为4类，插核刺激后血淋巴细胞在数量、分布和Ca2+水平上迅速响应。此外，血淋巴细胞能控制方解石晶体的形貌。以上结果说明了血淋巴细胞能够响应插核刺激并且参与到CaCO3晶体的形成过程，这为进一步探究血淋巴细胞在贝类生物矿化中的调控作用提供了研究基础。
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