水产养殖是全球农业领域增长速度最快的行业之一，中国作为世界上最大的水产养殖国，其养殖产量近年来一直稳居世界首位^[1]。随着社会经济的不断发展，对水产品的需求也日益增加，因此，除了利用淡水和海水资源满足水产养殖的需求以外，开发目前尚处于荒芜闲置状态的盐碱水域来开展水产养殖，也逐渐成为我国渔业发展的重要途径之一^[2]。据统计，我国低洼盐碱水域约有4.6×10¹¹ m²，遍及19个省市和自治区^[3]，其中碳酸盐型所占面积比例最大^[4]，其中，碳酸盐浓度超过10 mmol/L的水域属于高盐碱类型，具有高pH、高碳酸盐碱度和主要离子成分(Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺、K⁺、${\rm{SO}}_4^{2 - }$、${\rm{HCO}}_3^ - $、OH^–、Cl^–等)比例失衡^[5]等特点，这些水资源既不能为人畜所饮用，又无法直接用于农业生产。目前，对于高碳酸盐碱水域的有效利用面积不足2%^[6]，严重浪费我国国土资源。

生物体内的代谢变化是其应对环境胁迫的第一反应^[7]。代谢物是所有活细胞维持正常生理过程的关键物质，解析其变化特征有利于深入了解生物体的生理状况^[8]。代谢组学技术是探索外部环境变化对机体影响的重要研究手段之一^[9]，它结合了生物化学、生物信息学分析，质谱(MS)、核磁共振(NMR)等诸多前沿技术，是继基因组学和蛋白质组学之后，在生命科学领域中逐渐获得科学家重视的研究工具^[10]。Peng^[11]等利用UPLC-QTOF/MS非靶向代谢组学技术，探讨了武昌鱼(Megalobrama amblycephala)在活体运输过程中肌肉纹理变化的代谢机制，Xie^[12]等为解析氧化鱼油对水生生物健康的影响，采用UPLC-QTOF/MS非靶向代谢组学技术探讨了投喂日粮氧化鱼油后，大口黑鲈(Micropterus salmoides)体内脂肪酸代谢与炎症反应之间的潜在关系。此外，非靶向代谢组学技术也常被广泛用于分析生物体内小分子代谢物的含量变化，以探讨环境胁迫对鱼类生理代谢的影响^[13-14]。由此可见，代谢组学技术逐渐成为研究水生生物环境适应性的主要研究手段之一。

鲫(Carassius auratus)是我国重要的经济淡水鱼类之一，具有环境适应性强、生长速度快和繁殖周期短等优点^[15]，已有研究将其作为探讨邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯^[16]、3，6-二氯咔唑^[17]以及全氟己酸^[18]等多种环境胁迫因子毒理学机制的可靠生物模型。肝脏是鱼类代谢过程中不可或缺的重要靶器官，在免疫防御、能量储存与供应、新陈代谢以及毒素分解等多种生理过程中发挥重要作用^[19-20]。因此，肝脏的健康状况与鱼类的生长发育息息相关。目前虽已有部分研究开展了有关盐碱胁迫对水生生物生长性能的探讨，但仅限于低浓度的盐碱环境^[21-22]，而对于高浓度下水生生物的生长性能以及相关代谢物的变化特征目前尚不清晰。

本研究以鲫肝脏为研究靶器官，采用生长参数测定和生化指标分析，结合UPLC-QTOF/MS非靶向代谢组学技术，解析碳酸盐碱胁迫对鲫生长性能和生理代谢过程造成的影响机制。在当下淡水资源可利用空间受限的大背景下，本研究旨在为盐碱水域中淡水硬骨鱼类的增养殖活动提供科学理论依据。

饲料选用山东通威饲料有限公司市售商品化鲫配合饲料，饲料具体成分参照前人实验方案^[23]。

松浦银鲫购自中国水产科学院黑龙江水产研究所呼兰试验站(中国，哈尔滨)。所有实验用鱼在盛有自来水的室内循环池(200 L，100 cm × 50 cm × 40 cm)中驯养2周后，选用大小规格一致，健康无外伤，体型壮硕的个体，随机分为3个处理组，每个处理组3个重复，每个重复15尾鱼，分别为对照组(淡水，Con)和两个NaHCO₃暴露组(20 mmol/L NaHCO₃，T; 40 mmol/L NaHCO₃，F)。暴露实验开始当天，准确测量初始体重和初始体长。为避免在暴露实验过程中鲫发生应激反应，碳酸盐碱度每天以5 mmol/L的速度升至实验所需浓度^[23]。本实验所设置的NaHCO₃浓度是基于我们之前对水生生态系统高盐碱性水域数据的实验所确定^[24-25]。

碳酸盐碱环境暴露期间，保持水温在(24±1.0) ℃，溶解氧>7.5 mg/L，氨氮<1.0 mg/L，Con组pH约为7.2，T组pH约为8.4，F组pH约为9.1，每周换水1/3，同时使用酸碱滴定法测定NaHCO₃浓度，并补充至实验所设浓度。每天投喂两次(8:30、17:30)，日投喂量约为鱼体重的3%，遵循三定三巡的饲养原则(定时定点定量投喂、早中晚巡查)，投喂30 min后，及时清理残留饵料和鱼类粪便，避免水质受到残饵污染。样品采集前禁食24 h。暴露8周后，统计鲫死亡尾数。在每个处理组中随机选取20尾鱼，测量各组鲫终末体重和终末体长。使用100 mg/L间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐溶液(MS-222)将鲫麻醉后，用2 mL无菌注射器从尾静脉处采集全血并转移至离心管中，于4 ℃ 静置沉淀2 h后，离心机3000 r/min离心10 min，取上清液即为血清，保存于‒80 ℃冰箱备用。接着在冰上迅速解剖出肝脏，对应称重并记录后，转移至冻存管内，立即置于液氮中冷冻，并在采样结束后24 h内将样品转移至‒80 ℃冰箱中保存备用。其中15份肝脏样本用于代谢组学分析，8份肝脏和8份血清样本用于生化分析。

每个处理组随机取8份血清样本，测量血清中血氨(blood ammonia)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量；随机选取8份肝脏样本用于测定抗氧化指标，超氧化物歧化酶(SOD)；过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性和丙二醛(MDA)含量，以上检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，所有生化指标检测均按照试剂盒说明进行。

每个处理组在‒80 ℃冰箱随机取出15份肝组织样本在‒4 ℃条件下解冻。准确称取100 mg样品于1.5 mL离心管中，每个样品管中分别加入3颗钢珠和600 μL预冷的80%甲醇水溶液(甲醇∶水=4∶1，v/v)，在–20 ℃条件下60 Hz速度均质3 min。冰水浴超声15 min后，在‒20 ℃下静置沉淀1 h，最后在4 ℃，13000 r/min条件下离心15 min。使用1.0 mL无菌注射器取上清液，经0.22 µm有机相针式过滤膜过滤至自动进样瓶中待测。从各组中取等量肝脏样品均匀混合后，按照上述样本所述的前处理方法制备质量控制(QC)样品，用于评估高分辨仪器的灵敏度和稳定性。

参考鱼类生态学方法^[27]，测定鲫的体重和体长，并计算其增重率、特性生长率、饲料系数、肝体比和肥满度。计算公式如下：

增重率(weight gain rate，WGR，%) = 100% × (末均重−初均重) / 初均重；

特定生长率(specific growth rate，SGR，%/d) = 100% × (ln末均重−ln初均重) / 饲养天数；

存活率(survival rate，SR，%) = 1005 × 终末尾数 / 初始尾数；

饲料系数(feed conversion ratio，FCR) = 摄食饲料干重 / (终末体重−初始体重);

肝体比(hepatosomatic index，HIS，%) = 100% × 每尾肝脏体重 / 每尾最终体重；

肥满度(condition factor，CF，g/cm³) = 100% × 末体重 / 体长³;

采用GraphPad Prism 9.5 (GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA)软件和SPSS 27对生化指标和生长数据进行单因素方差分析(ANOVA)，确定各组之间的差异显著性。结果用平均数±标准差($\bar x \pm {\rm{SD}}$)表示。

将在正负离子模式下采集的原始数据，导入Progenesis QI软件(美国Waters公司)，对色谱峰进行识别、提取和对齐等预处理操作。使用人类代谢组数据库(HMDB)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)等公共数据库对代谢物进行注释，生成含有保留时间、样本名称、质荷比和峰面积的数据矩阵。将数据矩阵导入分析软件SIMCA 14.1(瑞典Umetrics公司)进行主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)，以确定各组间的整体代谢变化。将在Student's t检验中以VIP>1和P<0.05为筛选条件筛选所得到的代谢物视为差异代谢物(DEMs)，MetaboAnalyst 5.0数据库对DEMs进行代谢通路富集分析。

如表1所示，Con、T和F组的增重率、饲料系数和特定生长率均发生显著变化(P<0.05)。随着碳酸盐碱浓度的升高，两个暴露组中鲫的增重率和特定生长率逐渐下降。其中，与Con组相比，T组和F组的增重率分别下降了14.48%和39.83%，特定生长率分别下降0.12%/d和0.35%/d，均在F组中显著低于Con组(P<0.05)。饲料系数与碳酸盐碱浓度成正相关，其中，T组和F组分别比Con组升高0.15和0.55，且F组的饲料系数显著高于Con组和T组(P< 0.05)，这说明高碳酸盐碱胁迫下，鲫的饲料转化率有所降低。与Con组相比，鲫的肝体比在碳酸盐碱暴露组中显著降低，而在两个暴露组间并无显著差异(P<0.05)。此外，鲫的肥满度在碳酸盐碱胁迫下也未表现出显著性差异(P<0.05)。

表1

表1 　不同浓度的碳酸盐碱胁迫对鲫生长性能的影响 Tab. 1 　Effects of different concentrations of carbonate alkaline exposure on the growth performance of Carassius auratus 组别group NaHCO3浓度/mmol/L NaHCO3 concentration 0 mmol/L 20 mmol/L 40 mmol/L 初始体重/g initial body weight 62.42±1.49a 62.32±1.59 a 61.72±2.02 a 终末体重/g final body weight 138.93±3.31a 129.69±3.31b 112.83±3.70c 增重率/% weight gain rate 122.56±1.14a 108.08±0.08b 82.73±0.12c 特定生长率/(%/d) specific growth rate 1.43±0.01a 1.31±0.001b 1.08±0.001c 存活率/% survival rate 100.0±0.0a 100.0±0.0a 100.0±0.0a 饲料系数feed conversion ratio 1.11±0.03c 1.26±0.03b 1.67±0.06a 肝体比/% hepatosomatic index 2.16±0.14a 2.03±0.03b 2.01±0.02b 肥满度/(g/cm3) condition factor 2.55±0.65a 2.69±0.40a 2.62±0.52a 注：同行数据上标小写字母不同表示组间有显著差异（P<0.05）. Note: Different lowercase letters indicate significant differences between groups (P<0.05).

表1 　不同浓度的碳酸盐碱胁迫对鲫生长性能的影响 Tab. 1 　Effects of different concentrations of carbonate alkaline exposure on the growth performance of Carassius auratus

碳酸盐碱胁迫56 d后，T组和F组的血氨含量增加(图1a)。F组中BUN含量显著高于Con组(P< 0.05)，而在T组与Con组之间并无明显差异(图1b)。如图1c~e所示，SOD、CAT活性和MDA含量变化均与碳酸盐碱浓度呈正相关趋势，且T组和F组均与Con组存在显著性差异(P<0.05)。如图1f所示，与Con和T组相比，GSH-Px活力在F组中显著提高(P<0.05)。如图1 g~h所示，F组中TC和TG含量均显著高于Con组(P<0.05)。

图1

图1 　不同浓度的碳酸盐碱暴露对鲫肝生化指标的影响a. 血氨；b. BUN；c. SOD；d. CAT；e. MDA；f. GSH-Px；g. TG；h. TC. Con为淡水对照组，T为20 mmol/L NaHCO3盐碱暴露组，F为40 mmol/L NaHCO3盐碱暴露组，*P < 0.05，**P < 0.01，*** P < 0.001，****P < 0.0001. Fig. 1 　Effects of different concentrations of carbonate saline-alkaline exposure on liver biochemical indices of Carassius auratusa. Blood ammonia; b. BUN; c. SOD; d. CAT; e. MDA; f. GSH-Px; g. TG; h. TC. Con is freshwater control group, T is 20 mmol/L NaHCO3 saline-alkaline exposure group, F is 40 mmol/L NaHCO3 saline-alkaline exposure group, *P < 0.05, **P < 0.01, *** P < 0.001, ****P < 0.0001.

PCA得分图显示，QC样本在较小的区域内表现出强烈的聚集，表明仪器具有较高的稳定性和实验数据具有可靠性。3个处理组内的样品点在正负离子模式下出现显著分离，而组间样品点虽然分布在不同的区域，但仍有小部分重叠，表明在不同浓度的碳酸盐碱暴露下，鲫肝脏代谢存在较大差异(图2a~b)。为了进一步分析不同处理组间肝脏代谢物的差异，采用有监督的OPLS-DA分析模型，它比PCA分析方法具有更有效的分类能力，能够通过降低系统噪声准确提取变量信息。如图2 c~d所示，正负离子模式下，Con组、T组和F组的代谢物之间出现明显的分离，各组样本均匀分布在不同的区域内。经过对OPLS-DA模型进行200次置换检验后(图2e~f)，正离子模式下R²Y和Q²的值分别为0.949和0.920，负离子模式下R²Y和Q²的值分别为0.963和0.863，数据表明OPLS-DA模型在正负离子模式下没有过度拟合，具有很高的可预测性，适合用于后续实验分析。

图2

图2 　鲫肝脏代谢组学PCA和OPLS-DA分析a-b. 正、负离子模式下PCA得分图；c-d. 正、负离子模式下OPLS-DA得分图；e-f. 正、负离子模式下OPLS-DA模型置换验证图. Con为淡水对照组，T为20 mmol/L NaHCO3盐碱暴露组，F为40 mmol/L NaHCO3盐碱暴露组，R2 表示OPLS-DA模型的解释方差，Q2表示OPLS-DA模型的预测能力. Fig. 2 　Metabolomic PCA and OPLS-DA analysis of Carassius auratus livera-b. The PCA score plots in positive and negative ion modes; c-d. The OPLS-DA score plots in positive and negative ion modes; e-f. The OPLS-DA permutation test in positive and negative ion modes. Con is freshwater control, T is 20 mmol/L NaHCO3 saline-alkaline exposure group, F is 40 mmol/L NaHCO3 saline-alkaline exposure group, R2 is the explained variance of the OPLS-DA model, and Q2 is the predictive ability of the OPLS-DA model.

为了更好地了解在不同浓度的碳酸盐碱暴露下，鲫肝脏代谢物的整体差异情况，以VIP>1，P<0.05作为筛选条件，筛选得到DEMs。如图3a~c所示，在Con vs. T组中共筛选到17种具有统计学意义的DEMs，包括12个上调，5个下调，在Con vs. F组中共筛选到100种具有统计学意义的DEMs，包括35个上调，65个下调。可视化的维恩图直观的展示了DEMs之间的覆盖性和特异性(图3d)，其中在Con vs. T、Con vs. F两个对比组中筛选到12种相同的DEMs。层次聚类分析显示，各组DEMs之间的相对含量存在显著差异(图4a)。 随后，采用MetaboAnalyst 5.0对DEMs进行代谢通路富集分析，结果显示，在Con vs. T组中，共富集到27条代谢通路，其中不饱和脂肪酸的生物合成、嘌呤代谢、甘油磷脂代谢和谷胱甘肽代谢等代谢通路受到显著影响(图4b)。随着NaHCO₃浓度不断升高，受影响的代谢通路数量显著增加。在Con vs. F组中，共富集到35条代谢通路，其中不饱和脂肪酸的生物合成、嘌呤代谢、甘油磷脂代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、乙醛酸酯和二羧酸酯代谢、花生四烯酸代谢和鞘脂代谢等多条代谢通路受影响最为显著(图4c)。

图3

图3 　鲫肝脏差异代谢物鉴定a，b. 差异代谢物火山图；c. 差异代谢物数量；d. 差异代谢物维恩图. Con为淡水对照组，T为20 mmol/L NaHCO3盐碱暴露组，F为40 mmol/L NaHCO3盐碱暴露组，FC为差异倍数，DEMs为代谢差异物. Fig. 3 　Identification of liver differential metabolites in Carassius auratusa-b. Volcano plot of differential metabolites; c. Number of differential metabolites; d. Venn diagram of differential metabolites. Con is freshwater control group, T is 20 mmol/L NaHCO3 saline-alkaline exposure group, F is 40 mmol/L NaHCO3 saline-alkaline exposure group, FC means fold change, DEMs means differential metabolites.

图4

图4 　不同浓度碳酸盐碱暴露下鲫肝脏代谢物及代谢途径富集分析a. 差异代谢物层次聚类热图；b. Con vs T组代谢途径变化；c. Con vs F组代谢途径变化. Con为淡水对照组，T为20 mmol/L NaHCO3盐碱暴露组，F为40 mmol/L NaHCO3盐碱暴露组. Fig. 4 　Analysis of liver metabolites and metabolic pathways enrichment analysis in Carassius auratus under different concentrations of carbonate saline-alkaline exposurea. Cluster heatmap of differential metabolites; b. Con vs. T group metabolic pathway enrichment analysis; c. Con vs. F group metabolic pathway enrichment analysis. Con is freshwater control, T is 20 mmol/L NaHCO3 saline-alkaline exposure group, F is 40 mmol/L NaHCO3 saline-alkaline exposure group.

在鱼类生长代谢过程中，蛋白质是其最重要的营养物质之一，而氨基酸作为蛋白质合成的前提物质能够直接为鱼类的正常生命活动提供能量基础^[28]。其中，在机体生长所需的必需氨基酸中，精氨酸是机体内的一种多功能性氨基酸，它不仅参与免疫反应，还能刺激鱼体释放生长激素，在维持鱼类良好的生长性能和健康方面发挥重要生理作用^[29]。目前，精氨酸的促生长作用已经在鱼类研究中被广泛报道，如斑点鲈(Lateolabrax maculatus)^[30]、幼黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)^[31]、翘嘴鲌(Culter alburnus)^[32]等。当生物体面临外界环境胁迫时，精氨酸通常会被降解为尿素、鸟氨酸、肌酸、瓜氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺等物质。其中，肌酸又称N-甲基胍乙酸或毒蕈碱酸，属于一种氨基酸衍生物，是动物体内有机合成的天然营养物质，其可以通过氧化磷酸化过程有效促进肝组织中三磷酸腺苷(ATP)与二磷酸腺苷(ADP)的相互转化。目前，有研究发现肌酸在提高鱼类免疫防御和生长性能方面发挥着关键作用^[33]。本研究的代谢组学结果显示，随着碳酸盐碱浓度的升高，鲫肝靶器官中肌酸和ATP的含量显著增加。Sun^[34]等发现，鱼类体内大量合成的肌酸会通过特定的质膜Na/Cl⁺⁺⁻被输送到能量需求量大的组织中，通过改善组织内线粒体的氧化磷酸化能力提高ATP的合成过程，促进机体的能量代谢，进而增强其生长性能。Burns^[35]等在探讨肌酸对低盐度环境下杂交条纹鲈鱼(HBS)生长性能的影响时发现，高含量的肌酸对杂交条纹鲈鱼应对环境胁迫具有积极影响。结合上述研究结果，我们发现随着碳酸盐碱浓度的升高，鲫通过产生更多的肌酸来调节自身的能量生成过程，用于满足碳酸盐碱暴露下鲫肝脏的高耗能需求。生长数据显示，碳酸盐碱环境暴露下，鲫的增重率、生长率和饲料转化率均显著降低，然而其存活率却无显著差异，这说明鲫对碳酸盐碱环境具有较强的适应性。但鲫为了适应高浓度的碳酸盐碱暴露，机体需要消耗大量的能量物质，造成其无法满足自身生长发育的能量需求，从而导致生长速度减缓。另有研究表明，外部环境变化导致鱼体内渗透调节失衡，从而减少了用于生长的能量物质供应^[36]，这与我们的研究结论一致。

除了生长性能以外，鱼类的生理状态也是目前鱼类研究中的焦点问题之一，而抗氧化能力是反应生理状态的重要指标。水生生物在应对环境胁迫时，往往会造成体内活性氧(ROS)过度积累而诱发氧化应激反应^[37]，导致多种疾病的产生，进而影响机体正常的生长发育。鱼类拥有完整的抗氧化防御系统，包括SOD、CAT和GHS-Px等主要抗氧化酶。其中，SOD和CAT在有效消减ROS的同时还能激活抗氧化酶的分子调控系统。SOD首先将有害的超氧阴离子(${\rm{O}}_2^ - $)转化为过氧化氢(H₂O₂)，减小环境胁迫对生物体造成的氧化损伤，随后体内产生CAT，而CAT会将SOD产生的H₂O₂进一步转化成水(H₂O)和氧气(O₂)，并阻止H₂O₂与O₂ 继续反应生成羟基自由基(·OH)，从而进一步减轻氧化应激对组织造成的损伤。在本研究中，SOD和CAT的水平随着碳酸盐碱浓度的升高而增加，同样，Ding等^[38]对鲫肾脏的研究发现，NaHCO₃浓度为20和40 mmol/L时，肾脏中SOD和CAT的活性显著升高。Wei等^[39]在研究鲫肝脏对碳酸盐碱胁迫的耐受机制时发现，F组相较于T组，其SOD和CAT活性均出现显著升高现象。这些研究结果表明，碳酸盐碱环境暴露激活了鲫体内的抗氧化防御系统。此外，GSH-Px和CAT的功能相似，都具有清除H₂O₂ 的能力。当体内H₂O₂含量先期升高时，GSH-Px率先参与机体的保护反应，而当H₂O₂过量产生对机体造成的伤害加剧时，CAT开始启动并参与保护反应。这两种氧化酶协同作用，共同保护靶器官细胞组织免受氧化应激损伤^[40]。本研究的GSH-Px酶活性测定结果显示，随着碳酸盐碱浓度的增加，肝脏中GSH-Px的酶活力显著升高。此外，结合代谢数据分析发现，还原型谷胱甘肽(GSH)含量在两个碳酸盐碱暴露组中均显著低于Con组，但同时氧化型谷胱甘肽(GSSG)的水平在两个暴露组中却显著升高。有相关研究发现，在碳酸盐碱环境中，GSH和H₂O₂能在GSH-Px的催化作用下产生GSSG和H₂O，以保护细胞结构和功能免受碳酸盐碱暴露引起的氧化损伤^[16]。在本项研究中，鲫的氧化应激表现与上述研究发现呈现相似结果，这说明碳酸盐碱暴露导致ROS的生成与清除过程出现失衡状态，而为了保护肝组织免受碳酸盐碱暴露造成的氧化应激损伤，鲫激活了体内氧化防御系统应对该生理困境。此外，氧化应激还会引起脂质过氧化反应，这一后果不仅会破坏细胞膜的完整性，还会导致细胞功能的紊乱，进而影响机体的健康状态。MDA作为脂质过氧化的重要标志性产物之一，常被用作评估氧化应激对生物体损伤程度的重要指标^[41]。本研究MDA测定结果显示，随着碳酸盐碱浓度的增加，肝脏中MDA的含量呈剂量依赖性增加的趋势，这与先前碳酸盐碱暴露会降低鱼类肠道抗氧化能力的研究发现相一致^[42]。同时，本研究结合代谢组学分析数据发现，多不饱和脂肪酸类物质如二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、α-亚麻酸(Alpha-Linolenic acid，ALA)和二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)等含量的变化表现出与MDA含量变化相似的趋势，而研究表明这类物质能够参与超氧化物的清除反应，在细胞中通常扮演抗氧化剂的角色^[43]。上述结果表明，碳酸盐碱暴露诱发了鲫的氧化应激反应，造成了肝脏损伤，而鲫为了维持机体的生理稳态和健康，激活了自身防御系统的抗氧化酶活性以应对环境对机体造成的不利影响。

脂质是鱼类生长发育所必需的重要能量物质之一，同时也是体内必需脂肪酸、磷脂和脂溶性维生素等营养物质的主要来源，在维持鱼类细胞膜生物功能和促进生长性能等方面发挥着重要生理作用^[44]。TG和TC是细胞主要的能量来源之一，它们在血清中的含量变化不仅可以反映鱼类肝脏的健康状况，还与体内脂质代谢密切相关^[45-46]。TG和TC分别参与体内脂质的分解和运输，其含量的增加不仅会干扰内源性脂质的正常转运，还会导致体内脂质的异常积累，而过量的脂质累积容易引起脂肪酸代谢紊乱，进而导致组织损伤^[47]。本研究结果发现，TG和TC的含量随碳酸盐碱浓度的升高而呈现增加的趋势，且均在F组中极显著高于Con组，这表明碳酸盐碱暴露引起了鲫肝脏中脂质的过度积累，导致肝组织严重受损，且伤害程度出现剂量依赖性趋势。此外，结合代谢组学分析数据我们发现，随着碳酸盐碱浓度的增加，鲫体内与脂肪酸代谢相关的多条代谢途径发生了显著变化，包括甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、花生四烯酸代谢和α-亚麻酸代谢等代谢通路。其中甘油磷脂和鞘脂是细胞膜的重要组成成分，而细胞膜的流动性与机体免疫能力密切相关^[12]。甘油磷脂代谢物如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酸(PA)等，不仅在维持细胞膜的完整性和流动性中占据重要生理地位，它们还能参与调节鱼类疾病的信号传导和能量转化，在一定程度上起到缓解组织损伤的保护作用^[48]。在正常生存环境下，这些甘油磷脂代谢物能够在体内被磷脂酶水解生成脂肪酸(fatty acid，FA)和溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholines，LPL)等物质，来参与DNA、RNA、蛋白质以及类花生酸的生物合成，以促进机体的快速生长和繁殖^[49]。在本研究中，与Con组相比，PC、PE和PA的水平在T组中变化不显著，而在F组中却显著降低。这表明在T组中，鲫通过体内信号传导作用，调节相关脂肪酸代谢产物，自身足以缓解此浓度下碳酸盐碱暴露造成的肝损伤和生理紊乱，而高浓度碳酸盐碱暴露可能由于严重破坏了细胞膜的稳定性，甘油磷脂代谢紊乱，进而造成了肝组织严重受损。在鞘脂代谢过程中所涉及到的代谢物如鞘磷脂(sphingomyelin，SM)、神经酰胺(ceramide，Cer)和鞘氨醇(sphingosine，Sph)等物质具有较高的生物活性，可以直接参与细胞的增殖活动和炎症反应^[50-51]。本研究的代谢组学数据分析结果显示，随着碳酸盐碱浓度的增加，Cer、SM和Sph的含量均有不同程度的下降。这表明碳酸盐碱胁迫可能造成了鲫肝脏中鞘脂代谢的紊乱，并且随着碳酸盐碱浓度的增加，机体需要消耗更多的鞘脂类代谢物来促进细胞增殖和参与炎症反应，这一结果与碳酸盐碱暴露下鲫鳃组织的生理变化结果类似^[52]。结合上述研究结果，我们推测碳酸盐碱暴露可能会破坏鲫肝脏细胞膜的结构和功能，并且随着碳酸盐碱浓度的升高，鲫肝脏中的脂质代谢紊乱加重，严重影响了鲫的生长发育和免疫防护作用。

本研究采用生长指标和生化分析方法，结合UPLC-QTOF/MS非靶向代谢组学技术，探讨了碳酸盐碱环境暴露对鲫的生长性能、生化反应和肝脏代谢的影响机制。结果表明，碳酸盐碱暴露显著抑制了鲫的生长速度，扰乱了其体内ROS与抗氧化系统之间的平衡，导致多种抗氧化酶的活性异常，进而造成了肝组织的氧化应激损伤。此外，随着碳酸盐碱浓度的升高，鲫体内的免疫防御系统遭到了严重破坏，诱发了鲫肝脏中与生长发育和免疫防护相关的精氨酸生物合成和脂肪酸代谢等多条关键代谢通路发生紊乱，从而抑制了细胞的增殖活动，严重阻碍了鲫的正常生长发育。本研究从生长指标、生化分析和代谢组学的角度，阐明了碳酸盐碱暴露对鲫生长性能和生理代谢过程的自身调控机理，为淡水硬骨鱼类在盐碱水域中的增养殖活动提供了理论依据。