中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)是我国重要的海水养殖经济物种之一，主要分布区域位于我国黄渤海和朝鲜半岛西海岸等海域，具有适应性强、耐低温、营养价值高等特点^[1]。20世纪80—90年代以来，中国对虾养殖技术取得重要突破，养殖产量快速上升。然而1993年暴发的白斑综合征使中国对虾养殖产量急剧下降，严重影响了中国对虾养殖业发展。为了培育具有生长速度快、抗病能力强的新品种，重振中国对虾养殖产业，中国水产科学研究院黄海水产研究所自1996年开始实施中国对虾良种选育计划，已先后培育了多个具有优良性状的对虾新品种^[2-5]，为中国对虾养殖产业可持续发展提供了优质的种质资源。

选择育种是中国对虾遗传改良过程中最常用的方法，利用数量遗传学原理构建核心群体，并对相关的经济性状进行遗传评估，根据既定选择强度保留具有优良性状的个体，同时在保证较低的近交水平下进行配种繁育，通过多代持续的定向选择，得到具有优良性状且稳定遗传的后代个体，最终培育出新品种^[6-7]。随着生物技术的进步，DNA分子标记技术逐渐成为研究水产动物遗传变异以及辅助育种的重要手段，已在水产动物遗传多样性、遗传变异分析、遗传图谱构建、分子标记辅助育种以及亲缘关系鉴定等方面取得了一定进展^[8-9]。与传统分子标记相比，SNP标记具有在基因组内分布密度高、遗传稳定等优势^[10]，逐渐成为遗传学研究中最常用的DNA分子标记手段。由于中国对虾基因组杂合度高，目前没有高质量参考基因组，一定程度限制了中国对虾分子标记辅助育种研究进展。近年来简化基因组测序技术的发展为水产物种SNP标记开发提供了新的研究手段^[11-12]。2b-RAD技术是一项经济、高效的简化基因组测序技术，与传统的简化基因组测序技术相比，该技术能够得到更多的分子标记和更加准确的分型准确率^[13]，可广泛适用于非模式生物连锁图谱构建以及遗传变异分析所需的高通量基因分型^[14-16]。

本研究中，中国对虾选育群体是自1998年开始，经过群体、家系累代选育与多性状复合育种技术相结合，先后于2008年和2017年获得的国家级水产新品种“黄海2号”和“黄海5号”，其中“黄海2号”是由中国对虾“黄海1号”“即抗98”2个选育群体以及朝鲜半岛南海群体、乳山湾群体、青岛沿岸群体及海州湾群体交配选育而成；“黄海5号”是由中国对虾“黄海2号”育种核心群、黄海群体、海州湾群体、朝鲜半岛西海岸群体组建而成的育种群体。新品种在抗病能力、生长速度、存活率等方面具有明显优势^[17]。本研究利用中国对虾4代选育群体和朝鲜半岛西海岸的野生群体进行2b-RAD简化基因组测序，并批量开发SNP标记，通过分析群体间遗传分化、遗传多样性和等位基因频率变化，了解人工选育群体与野生群体遗传多样性和遗传结构特征，挖掘在持续人工选育过程中受选择的SNP位点，为中国对虾人工选育和种质资源评价提供基础数据及理论依据。

本研究所用实验材料为两部分，选育群体来自中国水产科学研究院黄海水产研究所水产遗传育种中心利用家系选择与家系内选择相结合的方式培育的4代中国对虾选育亲本(2015年、2016年、2017年、2019年)，以下简称为Fc_2015、Fc_2016、Fc_2017、Fc_2019。取样时随机选取不同家系的亲本个体，样本数量分别为137尾、244尾、268尾、112尾；野生群体(WP)来自2017年引自朝鲜半岛西海岸的海捕亲虾个体60尾，合计821尾。所有样品取样后置于–80 ℃冰箱保存备用。

实验用TIANamp Marine Animals DNA Kit试剂盒(天根)提取中国对虾肌肉组织基因组DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳以及NanoDrop 2000紫外分光光度计(Thermo Fisher Scientific)对基因组DNA进行浓度及质量检测，质量检测结束后将样品DNA置于–20 ℃冰箱保存备用。

利用2b-RAD五标签串联技术^[18]参考Wang等^[13]的方法构建中国对虾简化基因组测序文库，利用IIB型限制性内切酶BsaXI对总量≥200 ng的基因组DNA进行酶切，文库构建过程中样品均采用5′-NNN-3′接头与酶切标签连接以得到更多的标记，文库质控合格后在Illumina Hiseq X Ten平台进行Paired-end测序。测序结束后利用Pear软件(Version 0.9.6)将成对的raw reads进行拼接得到拼接序列^[19]。同时对测序数据进行质控，过滤标准主要包括：过滤删除含有N碱基比例超过8%的reads；过滤质量值低于Q30的碱基超过15%的低质量reads；过滤含有接头序列的reads。raw reads经过过滤后得到clean reads，对clean reads进一步过滤，剔除不含有酶切识别位点的reads后，得到enzyme reads用于后续的生物信息学分析。

参照RAD-typing分型策略^[18,20]对全基因组SNP标记分型，利用SOAP软件^[21]将过滤得到的enzyme reads比对到参考序列后(参数为：–M 4 –v 2 –r 0)，利用最大似然法(ML)得到每个个体在每个位点的基因型。为了保证后续分析的准确性，全基因组SNP分型完成后对分型结果进一步过滤：剔除只含有1种等位基因的位点；剔除基因组碱基为N的位点；剔除同一位置两种分型的位点；剔除所有样品中低于80%个体可分型的位点；剔除最小等位基因频率(minor allele frequency, MAF)低于0.01的位点；剔除等位基因大于2的位点。

得到SNP标记分型结果后，按照群体为单位计算群体期望杂合度(H_e)、观测杂合度(H_o)、多态性信息含量(PIC)、核苷酸多态性(P_i)以及野生型等位基因频率(allele frequency)，利用SPSS 26.0软件对遗传多样性指数(H_e、H_o、PIC、P_i)平均值进行单因素方差分析，运用Duncan多重比较以P<0.05作为标准检验群体间是否存在显著性差异。利用Genepop软件(Version1.0.5)计算群体遗传分化系数(F_ST)^[22]，群体间遗传距离(Reynolds’ genetic distance, DR)由遗传分化系数(F_ST)计算得到。结合F_ST和P_i结果，对历代选育群体与野生群体进行选择消除分析，并筛选F_ST值最高的前1%和P_i Ratio (分别计算4个选育群体与野生群体θπ比值并取log10)的最低值前1%和最高值前1%作为候选位点，根据F_ST及θπ计算结果进行可视化展示。利用Excel软件筛选野生群体与不同世代选育群体等位基因频率差异SNP位点，利用R包Venn Diagram软件(Version 1.6.20)绘制相关差异SNP位点韦恩图^[23]。使用GCTA软件(version 1.26.0)对野生群体及选育群体，进行主成分分析(PCA)判断野生群体与选育群体之间是否形成群体结构分层^[24]。

利用TIANamp Marine Animals DNA Kit试剂盒(天根)提取中国对虾基因组DNA，通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA无明显拖尾现象，利用NanoDrop 2000紫外分光光度计进一步检测基因组DNA OD_{260 nm}/OD_{280 nm}在1.8~2.0，表明基因组DNA质量较好，可以进行后续的2b-RAD简化基因组建库及测序。

本研究利用中国对虾野生群体和4个世代选育群体合计821尾个体的2b-RAD简化基因组测序数据构建了中国对虾SNP数据库。所有样本测序后共得到30027775092条raw reads，平均每个样本的测序reads数为25533822个，筛选所有样本raw reads中含有Bsa XI酶切位点的高质量reads，共得到98996323个高质量reads，高质量reads所占比例为75.93%。对raw reads进行质控过滤后统计，所有样本共得到523367100个unique标签，每个样本平均获得unique标签数目为445040个，平均测序深度为28×，测序深度满足准确分型的要求。经过过滤后共得到83767个高质量的SNP位点，用于后续群体遗传多样性分析，筛选中国对虾在人工选择压力下受选择的SNP位点。

野生群体与选育群体期望杂合度(H_e)、观测杂合度(H_o)、多态性信息含量(PIC)、核苷酸多态性(P_i)等各项遗传参数统计及Duncan多重比较结果如表1所示，野生群体各项遗传多样性参数均低于选育群体。野生群体H_e、H_o、P_i与Fc_2015、Fc_2016群体相比无显著差异，但与Fc_2017、Fc_2019群体相比存在显著差异(P<0.05)；野生群体PIC与任一选育群体相比均存在显著差异(P<0.05)，选育群体之间Fc_2017、Fc_2019与Fc_ 2015、Fc_2016群体相比存在显著差异(P<0.05)。F-统计结果如表2所示，野生群体与选育群体不同世代F_ST范围在0.0190~0.0260，野生群体与Fc_2019群体之间分化程度最高，与Fc_2015群体之间遗传分化程度最低；野生群体与选育群体之间F_ST均小于0.05，属于弱遗传分化。群体间遗传距离(DR)结果显示野生群体与Fc_2019群体的遗传距离最远，与Fc_2015群体的遗传距离最近。

表1

表1 　中国对虾群体SNP位点遗传多样性参数统计 Tab. 1 　Statistics of genetic polymorphism parameters of SNP loci in populations of Fenneropenaeus chinensis n=83767; $\bar{x}\pm \text{SD}$ 群体 population 期望杂合度 He 观测杂合度 Ho 多态性信息 PIC 核苷酸多态性 Pi Fc_2015 0.1729±0.1610c 0.1866±0.2314c 0.1450±0.1217c 0.1737±0.1617c Fc_2016 0.1795±0.1576c 0.1890±0.2155c 0.1509±0.1189c 0.1799±0.1579c Fc_2017 0.1892±0.1598a 0.2084±0.2333a 0.1586±0.1199a 0.1896±0.1601a Fc_2019 0.1809±0.1624b 0.1931±0.2297b 0.1513±0.1230b 0.1818±0.1632b 野生群体 WP 0.1716±0.1676c 0.1861±0.2351c 0.1428±0.1278d 0.1732±0.1692c 注： 同列数据上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著. Note: Data in the same column with different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05), while the same letter means the difference is not significant.

表1 　中国对虾群体SNP位点遗传多样性参数统计 Tab. 1 　Statistics of genetic polymorphism parameters of SNP loci in populations of Fenneropenaeus chinensis n=83767; $\bar{x}\pm \text{SD}$

表2

表2 　中国对虾群体遗传分化系数(FST)和遗传距离(DR) Tab. 2 　Genetic differentiation coefficient (FST) and genetic distance (DR) in populations of Fenneropenaeus chinensis 群体 population Fc_2019 Fc_2017 Fc_2016 Fc_2015 野生群体 WP Fc_2019 – 0.0036 0.0105 0.0074 0.0263 Fc_2017 0.0036 – 0.0063 0.0032 0.0208 Fc_2016 0.0105 0.0062 – 0.0063 0.0236 Fc_2015 0.0074 0.0032 0.0062 – 0.0192 野生群体WP 0.0260 0.0206 0.0233 0.0190 – 注： 下三角为群体间遗传分化系数(FST)，上三角为群体间遗传距离(DR). Note: The lower triangle is the genetic differentiation coefficient (FST) between groups, and the upper triangle is the genetic distance between groups (DR).

表2 　中国对虾群体遗传分化系数(FST)和遗传距离(DR) Tab. 2 　Genetic differentiation coefficient (FST) and genetic distance (DR) in populations of Fenneropenaeus chinensis

中国对虾野生群体与选育群体间PCA分析结果如图1所示，野生群体出现明显的聚集现象，所有个体紧密聚为一簇，而选育群体不同世代之间没有明显的聚集现象，所有个体间分布较为广泛，且与野生群体样本之间有一定距离。

根据分型得到的83767个SNP位点信息，统计野生群体与选育群体野生型等位基因频率变化规律。结果如表3所示，与野生群体相比，Fc_ 2015、Fc_2016、Fc_2017、Fc_2019等位基因频率上升的位点数目均高于等位基因频率下降的位点数目。不同世代选育群体与野生群体等位基因频率变化的SNP位点差异如图2、图3所示，选育群体比野生群体等位基因频率上升的共有位点数目为30915个，占总位点数比例为36.91%，等位基因频率下降的共有位点数目为26906个，占总位点数比例为32.12%。不同世代选育群体与野生群体选择性消除分析结果如图4所示，图中紫色区域和红色区域分别代表筛选得到的选育群体及野生群体受选择位点，各选育群体与野生群体筛选得到的受选择SNP位点数目分别为92个、103个、166个、117个。将4组筛选得到的受选择SNP位点进行统计并绘制韦恩图，最终得到4个共有的SNP位点(图5)。筛选不同世代选育群体之间等位基因频率规律性变化的位点并绘制韦恩图，结果如图6、图7所示，选育群体相邻世代之间(Fc_2015-Fc_2016、Fc_2016-Fc_2017、Fc_2017-Fc_2019)，等位基因频率逐代上升的共有位点数目为7107个，其中3674个位点显著偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.05)；等位基因频率逐代下降的共有位点数目为8501个，其中4101个位点显著偏离哈迪温–伯格平衡(P<0.05)。

图1

图1 　中国对虾野生群体(WP)与选育群体(Fc_)主成分分析(PCA) Fig. 1 　Principal component analysis (PCA) of wild population (WP) and breeding populations (Fc_) of Fenneropenaeus chinensis

表3

表3 　中国对虾野生群体(WP)与选育群体(Fc_)等位基因频率变化 Tab. 3 　Change of allele frequency in breeding populations (Fc_) and wild population (WP) of Fenneropenaeus chinensis 群体 population 等位基因频率变化位点 change locis of allele frequency 频率上升位点数目 number of locis with increased frequency 频率下降位点数目 number of locis with reduced frequency Fc_2015-WP 42091 40053 Fc_2016-WP 44646 38018 Fc_2017-WP 45912 36315 Fc_2019-WP 42287 39306

表3 　中国对虾野生群体(WP)与选育群体(Fc_)等位基因频率变化 Tab. 3 　Change of allele frequency in breeding populations (Fc_) and wild population (WP) of Fenneropenaeus chinensis

图2

图2 　中国对虾选育群体(Fc_)与野生群体(WP)间等位基因频率上升位点Venn图≤≥ Fig. 2 　The Venn diagram of the increased allele frequency between breeding populations (Fc_) and the wild population (WP) of Fenneropenaeus chinensis

图3

图3 　中国对虾选育群体(Fc_)与野生群体(WP)间等位基因频率下降位点Venn图 Fig. 3 　Venn diagram of decreasing allele frequency between breeding populations (Fc_) and the wild population (WP) of Fenneropenaeus chinensis

图4

图4 　中国对虾选育群体(Fc_)与野生群体(WP)的FST和θπ选择消除分析a. Fc_2015/WP; b. Fc_2016/WP; c. Fc_2017/WP; d. Fc_2019/WP. Fig. 4 　Selective sweep analysis between breeding populations (Fc_) and the wild population (WP) of Fenneropenaeus chinensisa. Fc_2015/WP; b. Fc_2016/WP; c. Fc_2017/WP; d. Fc_2019/WP.

图5

图5 　中国对虾选育群体(Fc_)与野生群体(WP)差异SNP位点Venn图 Fig. 5 　Venn diagram of differences SNP loci between breeding populations (Fc_) and wild population (WP) of Fenneropenaeus chinensis

图6

图6 　中国对虾选育群体(Fc_)相邻世代等位基因频率上升位点Venn图 Fig. 6 　Venn diagram of the increase of allele frequency in neighboring generations of breeding populations (Fc_) of Fenneropenaeus chinensis

图7

图7 　中国对虾选育群体(Fc_)相邻世代等位基因频率下降位点Venn图 Fig. 7 　Venn diagram of the decreasing of allele frequency in neighboring generations of breeding populations (Fc_) of Fenneropenaeus chinensis

随着高通量测序技术的不断发展，分子标记技术被广泛应用于水产经济动物亲缘关系鉴定^[25]、种群遗传多样性分析^[26-27]以及遗传变异^[28]等研究方面。本研究通过2b-RAD技术对中国对虾4代选育群体和1个野生群体进行简化基因组测序，共得到30027775092条raw reads，筛选所有样本的raw reads中含有BsaXI酶切位点的高质量reads，共得到98996323个高质量reads，经过分型、过滤后，最终得到83767个高质量的SNP位点用于后续群体遗传多样性分析，以及筛选中国对虾在高强度人工选育压力下可能受选择的SNP位点。

遗传分化系数(F_ST)是衡量群体间遗传分化程度的重要参数，群体遗传分化对于物种的生存、繁衍和进化具有重要作用^[29]。本研究中F–统计结果显示，野生群体与选育群体之间F_ST均值为0.022，野生群体与选育群体之间F_ST均小于0.05，按照Wright^[30]对遗传分化指数(F_ST)标准的划分，F_ST值介于0~0.05，群体间属于弱遗传分化。选育群体与野生群体DR结果与F_ST结果相似，野生群体与Fc_2015群体间DR结果为0.0192，群体间遗传距离最近，与Fc_2019群体间DR结果为0.0263，群体间遗传距离最远，该结果与王凤娇等对中国对虾G₉~G₁₁ 3个连续选育世代遗传分化系数进行计算得到3个世代总F_ST为0.0061，选育群体未发生明显遗传分化的结论相似^[31]。本研究群体PCA结果显示，选育群体与野生群体并未发生明显的遗传结构改变。选育群体与野生群体之间遗传分化程度相当小，其遗传结构并未发生明显分层，该结果与王军等^[8]利用微卫星(SSR)分子标记技术对中国对虾第10代选育群体与韩国西海岸野生群体之间遗产变异分析得到的结果相似(选育群体观测杂合度H_o=0.810，香农指数H= 2.399，野生群体观测杂合度H_o=0.852，香农指数H=2.789，二者无显著性差异)；但不同于张辉等^[32]利用威海市乳山第一对虾养殖场中国对虾2009年养殖群体与野生群体(黄海及渤海水域) mtDNA控制区序列得到的两群体间存在显著的遗传分化(F_ST=0.0698, P=0.00)的结果，可能是研究中涉及的mtDNA控制区序列信息与本研究中基因组DNA序列信息存在较大差异，因而导致结果不同。本研究统计结果中选育群体F_st、DR以及PCA以及各遗传多样性参数结果相较于野生群体并未出现明显降低，说明人工选育群体依然具有较高的选育潜力。

遗传多样性统计结果中各选育群体PIC与野生群体存在显著差异(P<0.05)，选育群体与野生群体PIC平均值分别为0.1515和0.1428。PIC是衡量基因组DNA变异程度高低的重要参数^[33]，根据PIC划分标准，PIC>0.5为高度多态，0.25< PIC<0.5为中度多态，PIC<0.25为低度多态，说明野生群体与选育群体整体均属于低度多态性(PIC<0.25)，该结果略低于吴莹莹等^[34]利用非标记探针HRM法分析中国对虾39个EST-SNP位点遗传多样性结果(PIC均值为0.272)。造成该结果的原因与研究物种以及分子标记类型有一定关系。例如，岳志芹等^[35]利用AFLP分子标记技术对中国对虾4代抗病群体遗传多样性进行比较，结果表明群体间遗传多样性差异不显著；董丁健等^[36]对罗氏沼虾泰国群体3个世代遗传多样性进行分析，结果表明3个世代的等位基因数(N_a)、有效等位基因数(N_e)、观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)和多态性信息含量(PIC)随着世代增加呈逐代下降的趋势。在本研究中4代选育群体观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)和核苷酸多态性(P_i)平均值均高于野生群体，其中Fc_2017、Fc_2019群体H_o、H_e、P_i与野生群体间存在显著性差异(P<0.05)，这种结果可能是与中国对虾人工选育技术路线有关。中国对虾新品种“黄海5号”自2009年开始选育，基础群体包括中国对虾“黄海2号”育种核心群体、山东省海阳附近海域的黄海群体、日照市附近海域海州湾群体和朝鲜半岛西海岸群体等4个基础群体，选育群体综合了4个基础选育群体的遗传多样性。这与唐琼英等^[37]利用微卫星标记与线粒体基因分析相结合的方法，对罗氏沼虾4个选育群体遗传多样性进行研究，得到利用不同种质资源进行选育的数丰群体(SF)遗传多样性最高的结果相似；也与张芹等^[38]对黄河鲤野生群体和人工养殖群体遗传多样性分析得到养殖群体经过20多年人工选育后依然保持较高的遗传多样性结果一致。说明中国对虾在科学的人工选育条件下依然可以保持较高的遗传多样性。

人工选择并不能产生新的等位基因，但经过人工选育受选择位点的等位基因发生不同程度富集或缩减，使得与目的性状相关的位点基因频率不断积累或减少，最终达到选育目的。本研究对选育群体及野生群体进行选择消除分析得到的受选择SNP位点数目分别为92个、103个、166个、117个。选育群体比野生群体等位基因频率上升的共有位点数目为30915个，等位基因频率下降的共有位点数目为26906个。而对相邻世代选育群体之间等位基因频率规律性变化位点进行筛选，逐代上升的共有位点数目为7107个，其中3674个位点显著偏离哈迪–温伯格平衡(P<0.05)；等位基因频率逐代下降的共有位点数目为8501个，其中4101个位点显著偏离哈迪–温伯格平衡(P<0.05)。初步筛选得到的具有规律性变化的SNP位点还需要进行后续的功能验证，进一步挖掘与中国对虾人工选育目的性状相关的变异位点。随着中国对虾“黄海2号”“黄海5号”选育群体遗传改良进程推进，在定向选育过程中有利于生产的基因仍在不断富集、固定，中国对虾“黄海2号”依然具有较高的遗传选育潜力，可以继续作为选育材料。