褐篮子鱼(Siganus fuscessens), 俗称臭肚、泥鯭, 属于鲈形目、篮子鱼科、篮子鱼属, 广泛分布于中国东海、南海及太平洋、印度洋等海域^[1-2]; 其肉质细嫩、肉味鲜美, 深受消费者喜爱^[3]。褐篮子鱼属于偏藻食性的杂食性鱼类, 多与其他养殖品种混养于网箱或池塘中, 可有效清除网箱网衣附着藻类或池塘杂藻; 同时其具有生长速度快、适应能力强等特点, 为福建、浙江、广东主要的海水混养鱼类品种^[4-5]。近年来, 随着褐篮子鱼人工养殖规模扩大, 病害问题也越来越严重。目前国内有关褐篮子鱼疾病方面的研究较少, 仅见虹彩病毒引起褐篮子鱼“黑身病”的报道^[6]。近年来, 在池塘养殖篮子鱼出现了一种以鳃苍白为主要症状的疾病, 养殖户称其为“白鳃病”, 严重时可导致大量死亡。每年5—6月和10—11月褐篮子鱼都会发生该病, 病鱼主要表现为: 病鱼体表外观完好, 打开鳃盖可发现病鱼鳃丝发白, 呈极度贫血状态, 解剖病鱼观察内脏器官也呈贫血状态。

2019年10—11月福建省海水鱼类苗种繁育科研中试基地池塘养殖的褐篮子鱼大规模暴发以“白鳃”为主要临床症状疾病。为了确认该病发生病因, 本研究采集了该病病鱼样本, 通过流行病学调查、病原学和组织病理学等研究, 并结合分子生物学诊断技术, 确认了褐篮子鱼“白鳃病”发病的病原。该研究成果可为褐篮子鱼养殖过程中出现的“白鳃病”的诊断与防治提供科学依据。

患病的褐篮子鱼于2019年11月采集自福建省海水鱼类苗种繁育科研中试基地海水养殖的池塘, 病鱼体长(16.5±1.0) cm、体重(75.25±3.00) g。选取30尾临床典型症状的病鱼(濒死)做实验鱼; 另取3尾健康鱼做对照。

95%酒精和100%酒精由西陇科学股份有限公司生产, 常规海水细菌培养基2216E、弧菌选择性培养基(TCBS)由北京陆桥技术股份有限公司生产, DNA抽提试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司, PCR扩增引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成, 组织固定液购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

调查该病发病时间、发病鱼大小、病鱼感染情况、死亡情况及发病池塘水温、盐度等水质理化情况; 观察病鱼在养殖池塘中活动情况。取临床典型症状的病鱼(濒死)解剖观察, 观察病鱼体表体征、鳃及内脏器官情况, 描述体表、鳃丝及脏器典型性表观病理特征。

先用70%酒精棉擦拭病鱼体, 再用灭菌海水清洗病鱼体表, 然后无菌操作条件下从病鱼的肝脏、脾脏、肾脏和鳃等器官组织分离细菌, 划线接种于常规海水细菌培养基2216E平板和弧菌选择性培养基(TCBS)上, 置28 ℃恒温箱倒置培养24~48 h, 观察细菌菌落生长情况。

取临床典型症状的病鱼(濒死)体表黏液、鳃、鳍条及胃肠道内容物等制成水浸片, 显微镜下观察寄生虫情况, 确定大量单殖吸虫寄生于鳃丝, 剪取30尾病鱼半鳃, 置Olympus (SZX12)解剖镜下检查虫体并采集, 按文献[7]的方法统计病鱼鳃虫感染强度。

病鱼半鳃片经25%乙醇处理后, 在解剖镜下随机轻挑拨离微麻醉的单殖吸虫成体, 用吸管吸取虫体置于玻片, 制成水浸片置莱卡光学显微镜(Lw200-20T)下观察并拍照, 描述虫体形态特征, 并测量虫体、交接器、吸铗等分类特征的大小(括号前数值为测量平均值, 括号内为测量度量范围, n为测量虫体数)。

依形态学鉴定结果, 随机选取95%乙醇保存的采集虫体, 清洗, TE缓冲液(pH 8.0)浸泡过夜后, 分别装入1.5 mL离心管中, 使用捷瑞DNA抽提试剂盒(GK4002-100), 按说明书提取虫体基因组DNA, 并以其作为模板, 采用核糖体基因的28S rDNA序列扩增, 扩增引物系列如下: C1-28S-F: 5′-ACCCGCTGAATTTAAGCAT-3′, D2-28S-R: 5′- TGGTCCGTGTTTCAAGAC-3′。PCR扩增反应体系(50 μL): DNA模板2 μL, PCRMix 25 μL, 引物(C1-28S-F) 2 μL, 引物(D2-28S-R) 2 μL, dd H₂O 19 μL。PCR反应条件为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃复性30 s, 72 ℃延伸90 s, 进行35个循环; 最后72 ℃温育7 min, 4 ℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小, 扩增产物纯化后送至Invitrogen公司进行测序。将测序结果上传NCBI, 与核酸数据库(GenBank)中已知核酸序列经BLAST程序进行比对分析; 基于28S rDNA序列从GenBank数据库选取相似、相近的单殖吸虫序列(含本研究测得序列), 利用ClustalX 1.83软件对选取序列进行多重匹配比对并聚类分析, 用MEGA 7.0软件邻接法(Neighbor- Joining)构建系统发育树。

分别取发病鱼和健康鱼的鳃、肝、心脏、肾、脾等组织于组织固定液固定, 常规梯度酒精脱水、二甲苯溶液透明处理, 石蜡包埋后切片, 脱蜡后苏木精-伊红染色法(HE)染色, 经干燥后中性树胶封片, 然后在莱卡光学显微镜下观察并拍照。

褐篮子鱼“白鳃病”可在每年5—6月和10—11月发病, 发病温度范围22~28 ℃, 盐度1.019~ 1.022, 且发病鱼一般为成鱼。发病初期, 褐篮子鱼少量零星死亡; 发病高峰期, 每天死亡可达100多尾, 高峰期感染率可达90%以上; 如果未采取防控措施, 该病累计死亡率可达60%以上。发病时病鱼活动情况为: 在池塘边缓游或浮在水面, 偶尔打转沉底, 有时间歇性快速游动, 最后无力游动、身体失衡死亡。濒死病鱼体表外观完好, 无溃疡、缺损等其他异常病征, 解剖时剪断鳃弓主动脉未见出血(图1A); 病鱼鳃丝发白, 心脏浅红, 胃肠空、积液, 肝脏呈黄白色, 脾脏和肾脏暗灰色, 肌肉苍白无血色(图1B, 图1C)。

图1

图1 　褐篮子鱼“白鳃病”临床症状A. 发病鱼体表外观; B、C. 病鱼解剖图. Fig. 1 Clinical symptoms of white-gill disease in Siganus fuscessensA. Surface appearance of diseased fish; B and C. anatomy of diseased fish.

采用2216E平板和TCBS培养基对病鱼的鳃、肝、脾和肾等器官组织进行细菌分离培养, 28 ℃培养48 h后接种的培养基未观察到优势致病菌。

取鳃置于带自然海水的培养皿中, 肉眼可见病鱼鳃片发白, 鳃丝末端有白色虫体活动(图2A), 剪取小块鳃组织镜检, 发现有大量虫体用后吸器吸附于鳃片外区的鳃丝末端, 虫体扁平而长, 不断地伸缩活动, 鳃片区黏液多(图2B)。鳃经25%乙醇处理后, 培养皿中发白鳃丝有的崩解(图2C), 并有大量虫体从鳃脱落, 解剖镜下虫体呈披针状(图2D)。在所检查的30尾病鱼, 虫体感染率为100%, 病鱼半鳃感染强度为852~1142枚/尾, 平均半鳃感染强度为1026枚/尾, 属于重度感染。取病鱼体表黏液、鳍条及胃肠道内容物和内脏器官等组织显微镜检, 未发现有其他病原体寄生。结合病鱼发病特征、寄生虫体形态和鳃虫感染数量情况, 确认褐篮子鱼暴发“白鳃病”是由单殖吸虫引起的。

图2

图2 　病鱼鳃部寄生虫感染情况A. 鳃丝末端有白色虫体; B. 虫体吸附鳃末端, 鳃区黏液多(i. 虫体; ii. 黏液); C. 经25%乙醇处理后, 有大量虫体脱落; D. 解剖镜下虫体呈披针状. Fig. 2 Infection of worms in diseased fish gillsA. White worms at the end of gill filaments; B. the worm body adsorbs the end of the gills, and much mucus in the gills (i. worm body; ii. mucus); C. after 25% ethanol treatment, a large number of worms fell off; D. lanceolate worms under the dissecting microscope.

显微观察虫体, 虫体略扁呈近纺锤形披针状, 腹面观两侧对称, 成体体长为3.152 mm (2.850~ 4.152, n=30)(图3A)。虫体前端狭窄, 具1对分隔的椭圆形口吸盘, 长度为0.060 mm (0.048~0.076, n=40), 宽度为0.056 mm (0.046~0.070, n=40)(图3B); 咽近圆形, 后接食道; 肠在交接器水平分叉, 末端伸至后吸器后部; 卵黄腺沿肠支分布于身体两侧; 体中部宽, 最宽处为0.508 mm (0.420~0.650, n=30); 体后端与前体部区分明显, 具一高度特化后吸器(图3C), 长0.940 mm (0.725~1.250, n=30), 约占全长的1/3, 后吸器上两侧边缘排列着一行无柄微杯形吸铗, 吸铗由2片可张合的铗片组成(图3D), 吸铗总数为72~92个(n=30), 前中部的吸铗较大, 末端的吸铗较小。交接器为圆锥形几丁质管结构, 外包裹几丁质鞘, 高0.055 mm (0.045~ 0.062, n=30), 基部膨大, 直径为0.032 mm (0.026~ 0.034, n=30), 其两侧接有一对中等大小的前列腺管与前列腺囊; 输精管远端弯曲呈“S”形, 末端接入交接器基底(图3E)。卵巢多数形如问号; 睾丸在卵巢之后, 位于体中部稍后区域, 数量为9~15个(n=30); 虫卵呈梭形, 表面光整, 虫卵长为0.192 mm (0.180~0.210, n=6), 宽为0.080 mm (0.066~0.088, n=6), 两端具极丝, 前端极丝细长弯曲且末稍缠绕成团, 后端极丝短且较粗壮(图3F, 图3G)。

图3

图3 　褐篮子鱼“白鳃病”病原寄生虫形态学观察A. 虫体整体腹面观; B. 口吸盘; C. 后吸器; D. 吸铗; E. 交接器; F. 虫卵; G. 长极丝末梢缠绕成团. Fig. 3 Morphological observation on the pathogenic worm of white-gill disease in Siganus fuscessensA. Dorsal view of a whole worm; B. sucker; C. haptor; D. clamp; E. copulatory organ; F. egg; G. opercular filament with long and distally end winding.

该虫体形态特征与多唇虫属种类最相似, 具有高度特化后吸器, 后吸器左右对称且具2排微杯形吸铗, 交接器为几丁质管结构。通过与已报到相似的多唇虫测量数值进行比对(表1), 发现本研究发现虫种与文献[8]描述的马氏多唇虫相似种(Polylabris cf. mamaevi)最相似, 虫体大小相近, 吸铗和睾丸数目也相近, 交接器都为圆锥形几丁质管结构且量度相近。故认为二者是同一种, 该虫体属于马氏多唇虫相似种, 隶属于微杯虫科(Microcotyidae)、多唇虫属(Polylabris)^[11]。

经测虫体DCC-2019#的28S rDNA (C1-D2区)核酸片段长度为908 bp, 上传待测序列至NCBI数据库, 获得序列登录号为MT680612.1。将获得序列在数据库进行BLAST比对, 结果显示虫体DCC-2019#与数据库中马氏多唇虫相似种(P. cf. mamaevi) (登录号MH700591.1) 基因序列相似, 相似度达100%, 而与P. sillaginae (登录号GU289509.1)相似度达97.3%; 选取相似度相近的单殖吸虫28S rDNA序列构建系统发育树(图4), 系统发育树显示虫体DCC-2019#与马氏多唇虫相似种P. cf. mamaevi聚为一支, 置信度100%, 故将虫体鉴定为马氏多唇虫相似种P. cf. mamaevi。从而确认本次褐篮子鱼暴发“白鳃病”是由马氏多唇虫相似种寄生感染引起的。

表1

表1 　不同的多唇虫形态特征比较 Tab. 1 The morphological comparison of of different polychilia sp. 项目 item 多唇虫(本研究) Polylabris sp.(this study) 马氏多唇虫相似种[8] Polylabris cf. mamaevi 银鲈多唇虫[9] Polylabris gerres 海猪多唇虫[10] Polylabris halichoeres 宿主 host 褐篮子鱼 Siganus fuscessens 褐篮子鱼 Siganus fuscessens 长体银鲈 Gerres marcrosoma 云斑海猪鱼 Takifugu bimaculatus 体长 body length 3.152 (2.850-4.152) 2.811 (1.837-4.122) 2.079 (1.000-2.750) 2.59-3.42 最大体宽 greatest body width 0.508 (0.420-0.650) 0.446 (0.359-0.595) 0.294 (0.250-0.450) 0.51-0.61 后吸器长 haptor length 0.940 (0.725-1.250) – 0.817 (0.450-1.150) 0.69-0.98 口吸盘长 sucker length 0.060 (0.048-0.076) 0.061 (0.049-0.074) 0.059 (0.050-0.075) 0.055-0.061 口吸盘宽 sucker width 0.056 (0.046-0.070) 0.057 (0.049-0.072) 0.045 (0.030-0.052) 0.040-0.043 吸铗数目 number of clamp 72-92 54-94 68-112 56-64 睾丸数目 number of testes 9-15 9-14 10-16 9-13 交接器高copulatory organ height 0.055 (0.045-0.062) 0.053 (0.046-0.060) 0.042 (0.025-0.068) 0.037-0.045 交接器直径copulatory organ diameter 0.032 (0.026-0.034) 0.033 (0.027-0.037) 0.008-0.013 – 卵本体长 egg length 0.192 (0.180-0.210) 0.208 (0.194-0.218) 0.173 – 卵本体宽 egg width 0.080 (0.066-0.088) 0.064 (0.055-0.076) 0.080 –

表1 　不同的多唇虫形态特征比较 Tab. 1 The morphological comparison of of different polychilia sp.

图4

图4 　基于28S rDNA序列(C1-D2区)构建的多唇虫及其他外类群系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic tree of Polylabris spp. and relevant species based on the gene sequence of 28S rDNA (C1-D2 region)

组织病理学观察, 发现褐篮子鱼病鱼(濒死)主要器官鳃、肝、心脏、脾、肾等均发生了不同程度的病理变化。病理切片观察显示, 发生“白鳃病”的褐篮子鱼病变最严重的器官是鳃, 病鱼整个鳃丝和鳃小片崩解(图5A), 鳃血管和鳃小片毛细血管未见有红细胞(图5B); 而健康褐篮子鱼鳃丝和鳃小片规律排列, 结构清晰、完整(图5C), 鳃血管可见大量红细胞(图5D)。

病鱼肝组织出现退行性变化, 各肝细胞间界限模糊, 细胞核固缩, 肝内血管未见到红细胞(图5E); 而健康鱼肝细胞呈多边形, 排列均匀有规则, 肝内血管可见大量红细胞(图5F)。

病鱼脾血窦和脾血管缺血, 未见到红细胞(图5g), 而健康褐篮子鱼脾组织、脾窦和脾血管可见大量红细胞(图5H)。

病鱼心脏组织缺血, 心肌间只见少量红细胞(图5I), 而健康褐篮子鱼心肌间可见大量红细胞(图5J)。

病鱼肾组织和肾血窦也未见有红细胞(图5K), 而健康褐篮子鱼肾组织、肾血窦含有大量红细胞(图5L)。

图5

图5 　褐篮子鱼组织器官病理切片图A. 患病鱼鳃丝和鳃小片崩解; B. 患病鱼鳃血管无红细胞; C. 健康鱼鳃丝和鳃小片规律排列, 结构完整; D. 健康鱼鳃血管有大量红细胞; E. 患病鱼肝细胞之间界限模糊, 细胞核固缩, 肝内血管未见红细胞; F. 健康鱼肝细胞呈多边形均匀排列, 肝内血管可见大量红细胞; G. 患病鱼脾窦和脾血管未见红细胞; H. 健康鱼脾窦和脾血管可见大量红细胞; I. 患病鱼心肌间只见少量红细胞; J. 健康鱼心肌间有大量红细胞; K. 患病鱼肾组织未见红细胞; L. 健康鱼肾组织有大量红细胞. Fig. 5 Histopathological examination of tissues of diseased Siganus fuscescensA. Disintegration of gill filaments and lamella of diseased fish; B. gill vessels of diseased fish without red blood cells; C. gill filaments and lamella of healthy fish with regularly arrangement and clearly structure; D. gill vessels of healthy fish with a large number of red blood cells; E. in the diseased fish, the boundary between the hepatic cells was blurred; hepatocytes karyopyknosis, and no red blood cells were found in hepatic vessels; F. in the healthy fish, polygonal liver cells were evenly arranged, and there were a large number of red blood cells in hepatic vessels; G. no red blood cells were found in the splenic sinus and blood vessels of diseased fish; H. a large number of red blood cells were found in the splenic sinus and blood vessels of healthy fish; I. very few red blood cells were found in the heart tissue of diseased fish; J. a large number of red blood cells were found in the heart tissue of healthy fish; K. no red blood cells were found in the kidney tissue of diseased fish; L. a large number of red blood cells were found in the kidney tissue of healthy fish.

本研究通过褐篮子鱼“白鳃病”流行病学调查、发病症状、寄生虫学检查及虫体形态学特征和分子生物学诊断, 确认福建省海水鱼类苗种繁育科研中试基地池塘养殖的褐篮子鱼暴发“白鳃病”是由马氏多唇虫相似种大量寄生感染引起的。有关多唇虫寄生篮子鱼的研究已有大量报道, 包括多唇虫虫体形态学^[8,10-12]、系统发育^[9]、种群生态学等研究^[13-14], 但马氏多唇虫相似种大量寄生能引起褐篮子鱼“白鳃病”发生属首次报道。

多唇虫属虫种的虫体形态特征非常相近, 传统区分多唇虫属内种级特征主要依靠吸铗数量、睾丸数量和交接器结构等, 截至目前共报道有22种多唇虫属虫体^[9]。由于该属虫体形态特征非常相近, 单纯依托形态学特征鉴别比较困难和耗时, 利用分子生物学诊断可给予多唇虫属虫种更好辅助鉴定。本研究采用虫体形态学特征分析、28S rDNA序列分析和系统发育树构建等手段将褐篮子鱼“白鳃病”病原鉴定确认为马氏多唇虫相似种。马氏多唇虫相似种最早被Mamaev等^[15]描述记录于1976年, 初命名为银鲈多唇虫(P. gerres), 宿主为点篮子鱼(S. stellatus)和黄斑篮子鱼(S. oramin); 而Ogawa等^[16]研究认为Mamaev鉴定有误, 将寄生于点篮子鱼的多唇虫虫种重命名为新种马氏多唇虫(P. mamaevi); 国内学者杨廷宝等^[8]发现寄生在褐篮子鱼虫种与Mamaev等^[15]采集自黄斑篮子鱼的多唇虫标本为同一虫体, 认为其形态与寄生于点篮子鱼的马氏多唇虫相似, 故将该虫种命名为马氏多唇虫相似种; 而邹小梅^[9]以马氏多唇虫相似种、银鲈多唇虫、黄鳍鲷多唇虫(P. angifer)三者虫体形态特征相近, 且28S rDNA和ITS1的序列核苷酸差异值为0, 认为它们属同一虫种, 只是同物异名。因本研究未采集到银鲈多唇虫和黄鳍鲷多唇虫虫种, 无法验证它们是否为同一多唇虫虫种, 故虫种仍按杨廷宝的研究结果命名, 确认该虫种为马氏多唇虫相似种。同时, 本研究还发现同一池塘养殖的石斑鱼和笛鲷并未发生该病, 鳃也未检出该虫, 表明马氏多唇虫相似种对褐篮子鱼具有宿主特异性。

鱼鳃是由鳃丝、鳃弓和鳃耙组成的, 鳃丝上密布着毛细血管, 是鱼类最重要的呼吸器官。健康活鱼的鳃为鲜红色, 而“白鳃”主要以鳃丝发白为临床特征, 发病时病鱼呈极度贫血状态, 是一种海水养殖鱼类常见的疾病症状。研究表明, 不同的病原(包括病毒、细菌、孢子虫和单殖吸虫等)都能引起鱼类“白鳃”发生, 杨小强^[17]发现虹彩病毒能引起大黄鱼(Larimichthys crocea) “白鳃病”发生; 范文辉等^[18]报道了哈维氏弧菌引发大菱鲆(Scophthalmus maximus)溃疡, 从而继发感染引起白鳃、贫血; 施慧等^[19]发现寄生性黏孢子虫也能引起网箱养殖的大黄鱼出现“白鳃”症状; 张剑英等^[20]报道寡钩类单殖吸虫大量寄生可引起鱼类出现“白鳃”症状。研究表明, 不同病原导致的鱼类“白鳃”病因存在差异, 其中病毒、细菌、孢子虫等病原大量感染鱼类过程中, 主要是破坏鱼类的造血器官, 引发病鱼障碍性贫血, 从而导致“白鳃”的发生, 此时病鱼的脾脏、肾脏等多表现为肿大^[17-19]; 而嗜血性寡钩类单殖吸虫主要是通过大量吸食宿主血液, 从而造成宿主出现“白鳃”症状, 此时宿主内脏器官如脾、肾等不出现肿大, 而是因失血呈现为褪色贫血状态^[21]。本研究临床解剖显示, 患“白鳃”褐篮子鱼的鳃、肝、心脏、脾、肾、肌肉等组织器官均呈现出贫血状态, 组织病理观察显示病鱼鳃、肝、脾、肾等器官未发现红细胞, 病鱼呈现大量失血, 与嗜血性寡钩类单殖吸虫引发的宿主疾病症状相同, 表明马氏多唇虫相似种是引起此次篮子鱼“白鳃”的主要病因。

“白鳃病”是褐篮子鱼养殖生产上主要致死性病害之一, 其由马氏多唇虫相似种大量寄生引发的。马氏多唇虫相似种通过后吸器吸铗固着宿主鳃丝上, 然后大量吸取宿主血液, 引起宿主鳃和内脏贫血。从组织切片观察可知, 鳃是该病病变最严重的器官, 所以马氏多唇虫相似种大量寄生对褐篮子鱼鳃部损伤是致命的, 一方面虫体大量寄生于褐篮子鱼鳃丝远端, 吸食血液造成鳃损伤, 如Geets等^[22]认为鳃丝远端处薄有利于嗜血性单殖吸虫刺穿损伤吸血; 另一方面, 大量虫体在鳃丝爬行或用发达后吸器吸铗固着, 会造成褐篮子鱼鳃丝严重损伤, 引起鳃溃烂。故生产上利用甲苯咪唑溶液(国标渔药)或渔用敌百虫等抗单殖吸虫药物(敏感鱼类慎用)对马氏多唇虫相似种引发的“白鳃病”防治时, 还需要伴饲投喂抗生素, 以防止篮子鱼病后继发细菌性烂鳃。因本研究发现的马氏多唇虫相似种尚未能离体培养, 故有关其感染引发褐篮子鱼“白鳃病”发生进程及感染机制都还有待进一步深入研究。