2023, Vol. 30 
2. 水产养殖国家级实验教学示范中心，湖北 武汉 430070
3. 淡水生态与生物技术国家重点实验室，中国科学院水生生物研究所，湖北 武汉 430072
2. National Demonstration Center for Experimental Aquaculture Education, Wuhan 430070, China
3. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China
蛋白质是水产动物饲料中的主要成分，我国水产饲料中使用的鱼粉和大豆等传统蛋白源严重依赖进口，并且目前鱼粉和豆粕的价格分别达到约13000和5000元/t，蛋白源紧张已限制了水产养殖业发展。为减少传统蛋白源的用量，新型蛋白源得到广泛研究[1]。乙醇梭菌蛋白(Clostridium autoethanogenum protein, CAP)是一种新型细菌蛋白源，它是用乙醇梭菌以一氧化碳(CO)为原料通过液体发酵后加工得到[2]。乙醇梭菌蛋白的粗蛋白含量高(80%以上)，氨基酸均衡，富含赖氨酸、蛋氨酸，且不含抗营养因子，易于水产动物消化吸收[1]。并且，我国每年至少产生1.2万亿立方米富含CO的工业尾气，如果利用这些工业尾气则每年可以生产乙醇梭菌蛋白1000万t，相当于2800万t进口大豆。但是，目前对乙醇梭菌蛋白的研究仍处于初步阶段，尚未大规模应用。
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖鱼类，其食性广、肉质鲜嫩。随着人们生活水平的提升，草鱼肉品质受到消费者关注。质地特性、蒸煮损失、pH和抗氧化能力是重要的肉质评价指标[3-4]。有研究表明，以鱼粉和酪蛋白为蛋白源时，适宜的饲料蛋白质水平不但促进草鱼生长，还可以改善草鱼肌肉质地和抗氧化能力[5]。当仅使用豆粕为蛋白源时，也发现适宜的蛋白质水平可提升草鱼肌肉品质[6]。在草鱼中，关于乙醇梭菌蛋白的研究非常有限，魏洪城等[1]认为添加5%的乙醇梭菌蛋白替代豆粕可促进草鱼生长，维持草鱼健康[1]。董立学等[7]分别使用CAP和豆粕作为单一蛋白源对草鱼幼鱼(5.36 g)进行养殖试验，结果表明CAP可以达到与豆粕相近的饲料价值。同样，夏世森等[8]研究发现草鱼(80 g)对CAP作为单一蛋白源的饲料利用能力与豆粕和小球藻蛋白相同，并且明显强于棉籽浓缩蛋白和黄粉虫。但是，尚未见CAP对草鱼肌肉品质影响的研究。此外，草鱼以CAP为单一蛋白源时，其蛋白质水平会如何影响草鱼肌肉品质值得研究，这将为合理使用CAP提供参考。
饲料中过量的乙醇梭菌蛋白使用可导致鱼类的氧化应激[9]。氧化应激产生的自由基会损害肌肉细胞结构、改变新陈代谢和抑制风味前体的形成，对肉质产生不利影响[10]。因此，以乙醇梭菌作为草鱼饲料白源时，应确定其适宜含量以免影响肌肉品质。使用新型蛋白作为单一蛋白源进行评估可以为水产饲料中的新型蛋白源的合理应用提供理论依据[8]。并且CAP作为一种新型细菌蛋白，对水产动物的肌肉品质影响尚不清楚，所以本研究以CAP作为单一蛋白源，探究蛋白质水平对草鱼肌肉组织结构、营养成分、质构特性、抗氧化能力和基因表达的影响，从而评估CAP的营养价值，为CAP在草鱼饲料中应用提供参考，也为后续更多的研究做出重要铺垫。
1 材料与方法 1.1 实验饲料实验饲料配方和营养成分如表1所示。以 CAP为蛋白源，配制6种蛋白质水平(24.45%、27.31%、31.82%、35.79%、38.64%和42.82%)的实验饲料，分别命名为CAP1、CAP2、CAP3、CAP4、CAP5、CAP6。CAP由河北首朗新能源科技有限公司提供，含粗蛋白84.21%、粗脂肪0.19%、水分7.14%、灰分3.27%、总能24.10 MJ/kg。将原料粉碎后过80目筛，称重，用小型混合机(M-256，华南理工大学实验机械厂)混匀后制成膨化饲料(原料水分为21%，膨化温度为130 ℃，孔径2.0 mm)，室温干燥后储存在‒20 ℃。
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表1 不同蛋白质水平实验饲料配方和营养成分(以干物质百分比表示) Tab. 1 Experimental feed formulations and nutritional components at different protein levels (expressed as percentage in dry matter) |
草鱼苗购自武汉市新洲渔场，正式实验前暂养两周以适应试验条件。将540尾初始体重(4.56± 0.01) g的草鱼随机分到18个缸，每缸30尾鱼。每种饲料随机分配3个养殖缸。采用微流水养殖系统(每缸水体300 L，换水1 L/min)养殖8周。养殖中采用自然光照，每天投喂两次(08:30和15:30)至饱食，用气石增氧使溶解氧含量在6 mg/L以上，水温为27~28 ℃, pH为7.3。
1.3 样本采集饲养试验结束时将鱼禁食24 h。用MS222 (75 mg/L，阿拉丁，上海)麻醉后，从每缸随机取5尾鱼，称全鱼重和去除内脏后空壳重以计算空壳率[空壳率(%)=100×空壳重/全鱼重]，然后取草鱼背部白肌样品，一部分在液氮中速冻后储存于‒80 ℃，用于RNA提取和酶活性测定；另一部分用4%多聚甲醛固定用于组织学观察。另取3尾鱼的肌肉分析其质构特性、pH和蒸煮损失。此外，每缸随机取5尾鱼在‒20 ℃下保存，用于肌肉营养成分分析。所有操作均在冰上进行。
1.4 样品分析 1.4.1 营养成分测定水分含量按国标GB 5009.3用105 ℃常压干燥法测定；灰分按国标GB 5009.4用马弗炉灼烧法测定；粗蛋白按GB 5009.5采用凯氏定氮仪K9860 (海能，济南)测定；粗脂肪按GB 5009.6采用索氏抽提法测定。
1.4.2 背部白肌蒸煮损失、pH和质构特性测定用便携式pH计(HM-17MX, Toadkk，日本)测定新鲜肌肉的pH。根据文献[11]方法测定肌肉蒸煮损失[蒸煮损失(%)=100×(蒸煮后肌肉重‒蒸煮前肌肉重)/蒸煮前肌肉重]。肌肉质构分析(TPA)使用TA.XT Plus分析仪(Stable Micro Systems, Godalming，英国)测定，检测参数如下：探头为平底圆柱形P/36R (直径20 mm)，测试速度为2 mm/s，停留时间为5 s，测试后的回程速度为5 mm/s，数据采集率为200 pps。
1.4.3 肌肉组织学观察固定后的白肌经不同梯度的乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡包埋(56~58 ℃)后，用石蜡切片机(Leica RM2135)切成7 µm厚的薄片，用苏木精-伊红(H&E)染色，在光学显微镜下观察。使用Image-Pro Plus (Version 6.0)软件测量肌纤维直径，每个切片统计4个视野。
1.4.4 背部白肌抗氧化能力测定解冻后称取白肌样品100 mg，与生理盐水按1∶9体积混合，冰浴中匀浆，在2500×g, 4 ℃下离心10 min，收集上清液，使用试剂盒(建成生物工程研究所，南京)进行超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)的活性和丙二醛(MDA)含量测定。
1.4.5 白肌基因表达测定用Trizol™试剂(Takara，大连)从肌肉中提取总RNA。随后，用去gDNA的PrimeScript RT试剂盒(Yeasen，上海)进行cDNA合成。参考NCBI数据库的序列设计实时定量PCR (qRT-PCR)引物(表2)，所有引物的扩增效率均在90%~110%区间内。qPCR使用Unique Aptamer™ qPCR SYBR® Green Master Mix试剂盒(Novogene，天津)在Light Cycler 480II荧光定量仪(Roche，瑞士)上进行检测。扩增程序为：95 ℃预变性5 min, 95 ℃变性10 s, 55 ℃退火20 s和72 ℃延伸20 s, 40个循环。本研究采用双内参法验证ef1-α和β-actin在肌肉组织内表达稳定性后，所有目的基因均以ef1-α和β-actin为内参，最后利用2–ΔΔCt的方法计算基因相对表达量。
1.5 统计分析数据表示为平均值±标准误($\bar{x}\pm \text{SE}$)。使用SPSS软件第26版(IBM，美国)进行数据分析。对结果进行正态性和方差齐性检验后，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan’s多重比较来分析各组间的差异。显著性水平为0.05。此外，采用正交多项式对比拟合各指标与蛋白质水平的回归模型(以R2判断)，并基于肌肉硬度值的二次函数估计草鱼饲料的适宜蛋白质水平。使用GraphPad Prism 8进行绘图。
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表2 实时荧光定量PCR引物序列 Tab. 2 Real-time PCR primer sequences |
如表3所示，乙醇梭菌蛋白作为蛋白源时，饲料蛋白质水平不影响草鱼背部白肌的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分(P>0.05)。
2.2 饲料蛋白质水平对草鱼背部白肌空壳率、蒸煮损失和pH的影响如图1所示，草鱼白肌空壳率(R2=0.595)和pH (R2=0.571)均随饲料蛋白质水平增加呈二次模型变化，且均在CAP4组达到最大值(P<0.05)。白肌蒸煮损失呈线性上升趋势(R2=0.816), CAP6组显著高于其他组，CAP4组和CAP5组其次(P<0.05)。
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表3 饲料乙醇梭菌蛋白质水平对草鱼背肌营养成分的影响(以鲜重计) Tab. 3 Effects of dietary Clostridium autoethanogenum protein levels on dorsal muscle proximate composition of Ctenopharyngodon idellus (on fresh-weight basis) n=3; $\bar{x}\pm \text{SE}$; % |
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图1 饲料乙醇梭菌蛋白水平对草鱼空壳率(a)、蒸煮损失(b)和肌肉pH (c)的影响不同上标的平均值差异显著(P<0.05). L表示线性模型(P<0.05); Q表示二次函数模型(P<0.05). Fig. 1 Effects of dietary Clostridium autoethanogenum protein level on empty shell rate (ESR) (a), cooking loss (b) and muscle pH (c) of Ctenopharyngodon idellusMean values not sharing a common superscript are significantly different (P<0.05). L indicates linear model (P<0.05); Q indicates quadratic model (P<0.05). |
如图2所示，乙醇梭菌蛋白作为蛋白源时，肉质指标，包括硬度、弹性、凝聚力、黏性、咀嚼力和回复力，均随饲料蛋白质水平增加呈先升高后降低的二次模型(P<0.05, R2=0.742、0.567、0.455、0.864、0.664和0.748)。并且，在CAP4组中检测到硬度、弹性、黏性和回复力的最大值，在CAP3组中发现了凝聚力和咀嚼力的峰值。
根据硬度值与饲料蛋白质水平的二次函数关系，求得肌肉硬度值最大时的饲料蛋白质水平为33.53% (图3)。
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图2 饲料乙醇梭菌蛋白质水平对草鱼背部白肌质构特性的影响a-f 依次为硬度、弹性、凝聚力、黏性、咀嚼力和回复力. 不同上标的平均值差异显著(P<0.05). Q表示二次函数模型(P<0.05). Fig. 2 Effects of dietary Clostridium autoethanogenum protein levels on the texture properties of dorsal white muscle of Ctenopharyngodon idellusa-f represent hardness, springiness, cohesiveness, gumminess, chewiness and resilience in order. Mean values not sharing a common superscript are significantly different (P<0.05). Q indicates quadratic model (P<0.05). |
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图3 饲料乙醇梭菌蛋白质水平与草鱼肌肉硬度的回归分析 Fig. 3 Regression analysis of dietary Clostridium autoethanogenum protein level and muscle hardness of Ctenopharyngodon idellus |
如图4a所示，乙醇梭菌蛋白作为蛋白源时，饲料蛋白质水平影响草鱼背部白肌微观结构，CAP1、CAP2、CAP5和CAP6组的肌纤维直径较大，而CAP3和CAP4组直径较小。且肌纤维直径和肌纤维密度呈现二次模型(P<0.05, R2=0.830和0.644), CAP4组检测到最小平均肌纤维直径和最大肌纤维密度(图4b、c)。
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图4 不同饲料乙醇梭菌蛋白质水平饲喂8周后草鱼的肌肉组织形态学a. 草鱼白肌肌纤维显微结构(苏木精伊红); b. 肌纤维直径(μm); c. 肌纤维密度(N/mm2). 不共用上标的平均值差异显著(P<0.05). Q表示二次函数模型(P<0.05). Fig. 4 Morphological observation of muscle tissue of Ctenopharyngodon idellus fed with different Clostridium autoethanogenum dietary protein levels for 8 weeksa. Observation on muscle fiber of white muscle in grass carp (hematoxylin and eosin, ×400); b. The muscle fiber diameter (μm); c. The muscle fiber density (N/mm2). Mean values not sharing a common superscript are significantly different (P<0.05). Q indicates quadratic model (P<0.05). |
如图5所示。肌肉中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力随着饲料蛋白质水平增加而线性降低(P<0.05, R2=0.699、0.437和0.496)。丙二醛含量呈先下降后上升的二次模型(P<0.05, R2=0.653)。
2.6 草鱼背部白肌基因表达如图6所示，myod、myog、myf5、mstn、fgf6a、fgf6b、myhc-2、myhc-4、tor、s6k1、nrf2、keap1a、ck2α、igf-I和igf1r在肌肉中的表达呈现二次模型变化(P<0.05, R2=0.641, 0.608, 0.682, 0.625, 0.409, 0.671, 0.778, 0.434, 0.507, 0.446, 0.656, 0.748, 0.681, 0.502和0.344)。此外，在CAP4组中检测到igf-II的相对表达水平显著高于CAP2组(P<0.05)。myhc-7和myhc-1基因表达随饲料蛋白质水平呈线性上升趋势(P<0.05, R2=0.499和0.487)，而各组4e-bp1和mrf4表达水平无显著差异(P>0.05)。
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图5 饲料乙醇梭菌蛋白质水平对草鱼背部白肌抗氧化能力的影响a. 过氧化氢酶(U/mg prot); b. 超氧化物歧化酶(U/mg prot); c. 总抗氧化能力(mmol/g prot); d. 丙二醛(nmol/mg prot). 不同上标的平均值差异显著(P<0.05). L表示线性模型(P<0.05); Q表示二次函数模型(P<0.05). Fig. 5 Effects of dietary Clostridium autoethanogenum protein level on the antioxidant capacity in the dorsal white muscle of Ctenopharyngodon idellusa. Catalase (U/mg prot); b. Superoxide dismutase (U/mg prot); c. Total antioxidant capacity (mmol/g prot); d. Malondialdehyde (nmol/mg prot). Mean values not sharing a common superscript are significantly different (P<0.05). L indicates linear model (P<0.05); Q indicates quadratic model (P<0.05). |
近年来，鱼肉品质越来越受到人们的关注。鱼体的可食部分比例和肌肉营养成分是消费者关注的鱼肉品质特征。本研究中，空壳率随饲料蛋白质水平增加呈二次模型变化，适宜饲料蛋白质水平(CAP4, 35.79%)下草鱼空壳率最高，鱼体可食用部分比例最高。这与胡毅等[12]的研究结果相类似，草鱼的脏体比随饲料中蛋白质水平升高呈降低趋势。众所周知，肌肉是鱼体可食部分的最主要组成，鱼体可食用部分增加主要依靠肌肉生长，包括肌纤维的生成和肥大[13]。肌源性调节因子MRFs (包括myod、myog、myf5和mrf4)在卫星细胞活化、成肌细胞增殖和肌纤维肥大中起关键作用[14-15]。本研究中，相比于低蛋白饲料组和高蛋白饲料组，CAP4组草鱼显著上调肌肉中myod、myf5和myog mRNA表达，这表明适当的饲料蛋白水平可以通过增加肌细胞增殖和分化来促进肌肉发育。此外，mstn基因是转化生长因子β超家族的成员，主要作用是限制肌肉生长[16]；而fgf6与草鱼肌纤维增殖和肥大密切相关[11]。本实验中，草鱼肌肉mstn基因随蛋白质水平呈先下降后上升的趋势，而fgf6则呈相反趋势，这进一步表明CAP4 (35.79%)蛋白质水平对肌肉生长的促进作用。这与Wang等[6]使用豆粕作为单一蛋白源时研究结果相一致。
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图6 不同饲料乙醇梭菌蛋白质水平饲喂8周后草鱼肌肉基因表达情况a.肌源性调节因子(myod、myog、myf5和mrf4)、mstn、fgf6a、fgf6b和肌球蛋白重链(myhc-7、myhc-2、myhc-1和myhc-4)的基因表达. b. tor、s6k1、4e-bp1、nrf2、keap1a、ck2α、igf-I、igf-II、igf1r的基因表达. 用于检测基因myhc-2和myhc-4的cDNA稀释180倍，其他稀释6倍. 不同上标的平均值差异显著(P<0.05). Ns表示无模型(P>0.05); L表示线性模型；Q表示二次函数模型. Fig. 6 Muscle genes expression of Ctenopharyngodon idellus fed with different dietary Clostridium autoethanogenum protein levels for 8 weeksa. Gene expression of myogenic regulatory factors (myod, myog, myf5, and mrf4), mstn, fgf6a, fgf6b, and myosin heavy chain (myhc-7, myhc-2, myhc-1, and myhc-4) in muscle. b. Gene expression of tor, s6k1, 4e-bp1, nrf2, keap1a, ck2α, igf-I, igf-II, igf1r in muscle. The cDNAs used to detect genes myhc-2 and myhc-4 were diluted 180 times, and others were diluted 6 times. Means values not sharing a common superscript are significantly different (P<0.05). Ns indicates no structure (P>0.05); L indicates linear model; Q indicates quadratic model. |
肌肉生长还依赖于一些信号通路的激活。Pozios等[17]发现，igf-I和igf-II在斑马鱼(Brachydanio rerio)中通过与igf1r结合促进肌肉生长。同时，Zhao等[13]研究表明Igf-I可以激活促进肌肉蛋白质合成的AKT-TOR-S6K1通路。在本研究中，肌肉中igf (igf-I、igf-II、igf1r)、tor和s6k1的基因表达呈现出相似的先上升后下降的表达谱，这表明适宜水平乙醇梭菌蛋白(CAP4, 35.79%)促进草鱼肌肉生长可能是通过上调igf进而激活tor相关通路。这一具体分子调节机制值得进行深入研究。
本研究中，以乙醇梭菌蛋白为蛋白源时，饲料蛋白质水平对草鱼肌肉营养成分无显著影响。这与Xu等[5]使用鱼粉和酪蛋白作为蛋白源时的研究结果相一致。
3.2 适宜蛋白质水平提升草鱼肌肉持水性和质构特性低蒸煮损失意味着肌肉具有良好的持水能力和多汁性[18]。本研究中，蒸煮损失随蛋白质水平升高线性增加。这与Dong等[19]的结果相一致。但是，Wang等[6]的研究结果表明，蒸煮损失与饲料蛋白质水平呈抛物线关系。上述结果表明，蒸煮损失随蛋白质水平的变化趋势会受到饲料蛋白质类型的影响，其具体作用机理还有待进一步研究。此外，本实验中蒸煮损失整体上高于Wang等[6]使用豆粕、Dong等[19]使用混合蛋白源时不同饲料蛋白质水平处理下草鱼肌肉的蒸煮损失(分别为14.84%~20.20%以及22.78%~26.86%)。由此推测，乙醇梭菌蛋白相对于传统蛋白源会增加肌肉的蒸煮损失。同时，这些结果也说明可以通过饲料蛋白质水平和蛋白源类型来调控肌肉的持水能力和多汁性。
肌肉pH也是重要的肉质参数[20]。由肌糖原储备厌氧水解产生的乳酸积累，会降低肌肉pH[21]，增加烹饪损失[22-23]，从而不利于水产品的口感和储存。关于蛋白质水平对肌肉pH的影响研究尚不多见。Wang等[6]研究表明以豆粕作为饲料蛋白源时，肌肉pH在适宜饲料蛋白水平(32.26%)可以提升至5.36左右。本研究中，肌肉pH在CAP4组中达到最大值(5.44)，这表明适当的乙醇梭菌蛋白水平(35.79%)同样可以通过提高pH改善草鱼肉质，并且效果可能优于豆粕。
质构特性是评价水产品品质的重要参数。肌肉硬度是研究人员和消费者最关注的一项肌肉质构参数[24]。较高的鱼肉硬度代表水产品肉质的改善[4,25]，而硬度降低会影响消费者的满意程度和选择性[3]。本研究中，相对于其他处理组，CAP4组的硬度、弹性、黏性和回复力均为最大值，且硬度高达1487.1 g。这一数值高于Wang等[6]使用豆粕作为蛋白源时得到的草鱼肌肉硬度最高值(877.81 g)，同样高于Xu等[15]使用蚕豆作为蛋白源时得到的脆草鱼肌肉硬度值(660.44 g)。这在一定程度上表明适当的CAP水平对于肌肉质地提升的效果优于豆粕和蚕豆。当然，这还有可能受到鱼体规格、养殖环境等因素的影响，这些都有待进一步探索。根据肌肉硬度值与饲料蛋白质水平进行回归分析得出，本研究中的草鱼饲料适宜蛋白质水平为33.53%。众所周知，通过喂食蚕豆可以得到肌肉硬度极高的脆草鱼，其形成的主要机制是蚕豆中含有的L-3,4-二羟基苯丙氨酸会对机体造成损伤，而草鱼在不断的对抗氧化损伤过程中肌肉得到了脆化[26]。本研究中草鱼肌肉硬度的提升是否通过相似的脆化机制值得研究。值得注意的是，肌肉密度与肌纤维直径呈负相关关系[27]。本研究通过切片观察和肌纤维统计发现，高、低蛋白质水平均募集了更多的大直径肌纤维进而降低肌纤维密度；而在CAP4组(35.79%)可能通过增加新肌纤维的增生，募集更多的小直径肌纤维进而增加了肌纤维密度。而肌肉硬度受到肌纤维密度的影响，与肌纤维密度呈正相关[19,24]。这也说明，本研究中适当的蛋白质水平(35.79%)可能正是通过这种减小肌纤维平均直径、增加肌纤维密度的机制，从而改善肌肉硬度。这与Wang等[6]和Dong等[19]有关草鱼肌肉品质的研究结果相一致。
3.3 适宜蛋白质水平缓解草鱼肌肉氧化损伤肌肉抗氧化能力是与水产品肉质相关的重要指标[6,20]。抗氧化能力下降会引起氧化损伤，导致体内自由基的积累，影响肌肉细胞结构、新陈代谢和风味前体的形成，从而降低肉质[10]。CAT、SOD和T-AOC酶活性是评估抗氧化能力的重要参数，而MDA含量是反映机体氧化损伤的指标[6]。Nrf2信号通路可以调节抗氧化酶的基因表达，Nrf2易位进入细胞核，启动抗氧化酶的基因转录[28]。而Keap1是一种细胞质Nrf2结合蛋白，Keap1与Cul3形成泛素E3连接酶复合物，并使Nrf2泛素化，进而通过蛋白酶体系统快速降解Nrf2，从而抑制抗机体氧化酶系统[29]。本实验发现，nrf2及其下游靶基因的转录变化和酶活性随饲料蛋白质变化的规律存在差异，在酶水平上，饲料蛋白质水平与肌肉抗氧化酶的活性呈负相关；但MDA并未线性增加，而是在CAP4组表现最低，相应地，在转录水平上，适宜蛋白质水平(CAP4)显著上调肌肉nrf2通路相关基因表达。这可能意味着适宜蛋白质水平激活了nrf2通路试图改善抗氧化酶性能，而相关酶和蛋白质的反应可能相对滞后。这与Bao等[30]的研究结果相类似，当食蚊鱼(Gambusia affinis)暴露于双氯芬酸168 h时，诱导nrf2下游基因cat和sod2试图发挥防御作用，但相应的酶活性在168 h时没有显著变化。本研究中，适宜蛋白质水平通过上调nrf2相关通路来缓解氧化损伤，从而降低CAP4组的MDA含量，而过量的饲料蛋白质处理组通过高表达keap1，从而下调nrf2相关基因、削弱了抗氧化能力，导致肉质变差。这与Xu等[5]和Wang等[6]的研究结果相一致。此外，Okouchi等[31]研究表明mTOR可以调节人类细胞中Nrf2的表达；Bliesath等[32]证明ck2具有激活mtor通路的作用。这也进一步说明，本研究中tor和ck2α高表达可能在促进CAP4组草鱼肌肉生长的同时，还改善了草鱼肌肉的抗氧化能力，从而提升草鱼肉质。
3.4 适宜蛋白质水平通过肌球蛋白重链影响草鱼肉质肌球蛋白重链异构体(myosin heavy chain isoforms, myhcs)与肉品质具有密切联系。在水产动物中发现，IIB型重链基因(myhc-4)表达水平与肌肉硬度呈正相关关系[6]。本实验中CAP4组草鱼肌肉硬度最大，且肌肉II型肌纤维中IIX型(myhc-1)和IIB型(myhc-4)基因相对表达量较高，与前述正相关结果相符合。这种基因表达模式的变化意味着适宜饲料蛋白质水平可促进II型肌纤维的表达，进而提高肌肉硬度。值得注意的是，Kong等[27]研究发现，在草鱼饲料中使用20.6%的干酒糟及其可溶物(DDGS)替代棉籽粕时，虽然促进了myhc-1和myhc-4的基因转录水平，但肌纤维密度和肌肉硬度同时降低。这些差异结果表明，肌肉硬度的影响因素是多方面的和多途径的，肌纤维类型只是其中的一个因素，且存在各种影响因素的作用强弱差异。总体来说，肌纤维类型与鱼肉品质关系的研究还很有限。关于营养对于鱼肉品质的调节作用，后期还值得从肌球蛋白重链影响鱼类肉质的机制方面进行深入的研究。
4 结论本研究表明，乙醇梭菌作为蛋白源时，适宜饲料蛋白质水平(35.79%)可通过提高pH、肌肉质地和肌纤维相关基因表达，降低脂质过氧化物含量，进而改善草鱼肌肉品质。根据肌肉硬度与饲料蛋白质水平进行回归分析，估计最佳蛋白质水平为33.53%。
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