2023, Vol. 30 
外套膜是双壳贝类的重要器官组织，它能够分泌形成贝壳，帮助完成摄食、呼吸和排泄等多种生理功能，还具有保护机体的免疫作用[1]。由于它是贝壳形成的主要器官，参与了贝壳生物矿化、壳色形成、贝壳生长等多种生理过程，因此，对外套膜开展转录组研究，分析重要海产经济物种如牡蛎、栉孔扇贝、虾夷扇贝、厚壳贻贝、马氏珠母贝等贝类的贝壳形成，挖掘参与贝壳形成的蛋白和多糖等，探索贝壳壳色成因、生长调控等内在机制，一直是研究的热点[2-7]。
随着测序技术的不断发展，测序精度和深度不断提高，有学者开始通过外套膜转录组的分析研究病灶位于外套膜或贝壳的双壳贝类疾病内在机制，以及环境胁迫对贝类组织影响的分子机制。菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)褐环病(Brown Ring Disease, BRD)主要症状为褐色贝壳硬蛋白沉积在贝壳内侧，经研究发现致病菌为蛤弧菌(Vibrio tapetis)[8]。Allam等[9]利用转录组测序技术分析了患病和正常菲律宾蛤仔外套膜组织及外套膜与贝壳之间的腔隙液血细胞的分子响应机制及通路，结果发现显著调控的分子主要参与了病原识别、细胞凋亡和生物矿化等生物过程。才女虫病主要感染部位为贝类贝壳，对养殖生产有很大影响。Mao等[10]对感染才女虫的虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)外套膜边缘、外套膜中间部位、组织液中血细胞进行了转录组分析，揭示了扇贝贝壳形成机制和免疫调节相关信息。2012年，Zhang等[11]通过基因组和转录组分析发现双壳贝类的贝壳形成机制要比现有研究结论所发现的更加复杂，并揭示了不同环境胁迫条件下牡蛎基因的调控变化。其中HSP70和凋亡抑制因子调控对于环境胁迫条件下固着生活习性的牡蛎非常重要。
当前国内外研究领域，应用转录组测序双壳贝类外套膜组织，以分析贝类贝壳形成、壳色、生长的相关研究仍然占大多数，对贝类外套膜、贝壳类疾病进行相关研究的报道并不多见。虾夷扇贝“褐色沉积症”是多年来长海县海区筏养二龄虾夷扇贝大规模死亡的主要发病症状之一[12-13]。病症主要特征为外套膜颜色异常发黄、贝壳内侧出现褐色沉积物质等。研究发现褐色沉积物质与扇贝间碰撞等物理因素无关，可能与病害密切相关[14]。为探明虾夷扇贝褐色沉积症内在形成机制，挖掘相关关键基因，本研究对患病和健康虾夷扇贝外套膜进行转录组测序分析，对差异表达基因进行功能注释，通过与症状密切相关的关键基因进行研究，为病害诊断及预警奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料根据虾夷扇贝褐色沉积症流行病学调查结果[14], 2020年7月在长海县小长山岛镇英杰村虾夷扇贝筏式养殖海区采集100枚平均壳高为(7.02± 0.22) cm的虾夷扇贝，解剖后观察虾夷扇贝贝壳内侧及外套膜症状，选择9枚贝壳内侧褐色沉积症状严重，且沉积部位颜色异常的外套膜边缘组织，每3份样品混合，共计3个生物学重复(BW1, BW2, BW3)；同时选择9枚健康虾夷扇贝外套膜边缘组织，采取同样策略作为对照组(JW1, JW2, JW3)。液氮速冻后，运送至实验室–80 ℃保存。
1.2 实验方法 1.2.1 RNA制备、文库构建和高通量测序利用Total RNA Extractor (TRIzol)试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取患病和健康扇贝外套膜外缘组织总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品降解情况，采用Nanodrop2000、Qubit 2.0和Aglient 2100方法检测RNA样品纯度、浓度和完整性。
合格RNA样品送北京诺禾致源科技股份有限公司，采用Illmuina公司的NEBNext® UltraTM RNA Library Prep Kit完成cDNA文库的构建，并通过Illumina Hiseq 2500测序平台的125 bp paired-end模式进行转录组测序。
1.2.2 转录组质控和基因表达分析使用FastQC对原始数据测序质量进行评估，用In-house perl scripts去除带头、无法确定碱基信息比例大于10%和低质量的序列从而得到有效数据clean reads。
以虾夷扇贝全基因组序列作为参考序列，利用Hisat2 v2.0.4软件将过滤后的测序序列进行基因组定位分析，确定clean reads比对到参考基因组的比例大于70%。运用HTSeq v0.9.1软件，通过定位到基因组区域或基因外显子的测序序列(reads)评估基因表达水平[15]。根据FPKM (expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced)值判断基因是否表达(FPKM>1)[16]。
1.2.3 差异表达基因筛选及功能注释使用DESeq R package (1.18.0)[17]软件检测差异表达基因(differentially expressed genes), |log2(FoldChange)|>0且P值<0.005作为筛选标准。将差异表达基因与NR、NT、Swissport数据库进行对比和功能注释，对差异表达最显著的40个基因进行相关分析(P值越小，差异越显著)。同时利用GOseq软件和KOBAS (2.0)软件进行GO富集分析和KEGG富集分析[18-19]。
1.2.4 实时荧光定量RT-PCR分析随机选择6个差异表达基因，以β-actin作为内参基因。用Primer 5.0设计引物(表1)。使用Thermo公司的Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将总RNA合成cDNA，以逆转录产物为模板，使用Agilent公司的G8830A型实时荧光定量PCR仪进行定量分析。反应体系总体积10 μL：稀释10倍后的cDNA模板1.0 μL, Faststart Universal SYBR Green Master 5.2 μL，正反向引物各0.8 μL, RNase- Free ddH20 2.2 μL。反应程序：95 ℃ 10 min; 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 1 min, 30个循环；65~ 95 ℃间制作熔解曲线。采用2–ΔΔCt方法分析基因表达相对水平。
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表1 实时荧光定量RT-PCR引物 Tab. 1 Primers for qRT-PCR |
通过Illumina Hiseq平台转录组测序褐色沉积症和健康虾夷扇贝外套膜组织，分别获得平均45142628和43041204个原始数据，Phred数值大于20、30的碱基(Q20、Q30)平均百分比超过96.5%和92%，数据质量满足后续分析条件。原始数据过滤后分别获得平均43862251和41806737个有效数据(表2)。
以虾夷扇贝全基因组为参考序列，基因组定位分析过滤后序列，患病组和健康组定位到基因组上的测序序列平均达到78.14%和78.45%，其中比对到基因组外显子的平均比例分别为74.3%和66.4%，测序序列定位到基因组的比例超过70%，且比对到外显子的平均比例最高(与内含子和基因间区相比)，表明参考基因组选择较好，转录组测序序列可用(表3)。利用HTSeq v0.9.1软件计数定位到基因组区域或基因外显子的测序序列以评估基因表达水平，FPKM>1作为基因表达水平阈值，患病组扇贝外套膜表达基因17835个，健康组表达基因16816个(表4)。
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表2 转录组测序数据信息 Tab. 2 Information of transcriptomic reads |
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表3 有效测序数据与参考基因组对比表 Tab. 3 Comparision of total reads and reference genomes |
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表4 不同表达水平区间的基因数量 Tab. 4 The number of genes in different expression intervals |
应用DESeq R package (1.18.0)软件对基因表达水平分析中得到的数据进行标准化，计算假设检验概率(P-value)，多重假设检验校正后以|log2(FoldChange)|>0且P<0.005作为差异表达基因筛选标准。经统计分析后得到208个差异表达基因，其中上调基因170个，下调基因38个(图1)。
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图1 患病组和健康组虾夷扇贝外套膜组织差异表达基因分析 Fig. 1 Differentially expressed genes in mantle between diseased and healthy Mizuhopecten yessoensis group |
将差异表达基因映射到GO数据库进行功能富集分析，146个差异表达基因共注释了880个GO通路，其中包括生物过程458个，细胞组成134个，分子功能288个。富集程度最高的前30个GO功能注释中，生物过程13个，细胞组成4个，分子功能13个，显著富集的几丁质代谢过程、氨基葡萄糖代谢过程、几丁质结合、氨基糖代谢过程、氨基聚糖代谢过程5个GO功能注释均与几丁质相关。分子功能中氧化还原活性和细胞组成中细胞外区域部分差异表达基因数量较多(图2)。
使用KOBAS (2.0)软件对差异表达基因进行富集分析，总计富集到16条KEGG通路，均上调。校正后P值(corrected P-value)<0.05时，内质网蛋白质加工、细胞内吞、剪接体和谷胱甘肽代谢等4个KEGG通路显著密集(图3)。其中除谷胱甘肽代谢以外3个通路的相关上调基因主要是热休克蛋白家族(HSP40、HSP70、HSP73)基因，参与了内质网相关蛋白质降解途径(ERAD)、腔内伴侣蛋白识别、细胞质泛素化、网格蛋白囊泡、剪切因子PRP19等过程，谷胱甘肽代谢通路中上调基因表达了氨肽酶N。
2.3 与虾夷扇贝褐色沉积病相关的差异表达基因分析为分析虾夷扇贝贝壳内侧褐色沉积症形成内在机制，挖掘关键基因，利用NR、NT和Swiss数据库对差异表达基因进行注释，发现了34个新基因，另有65个基因在NR数据库和Swiss数据库中没有明确的蛋白功能注释。根据P值大小，对前40个差异表达显著的基因进行详细分析，发现这40个基因与蛋白醌鞣化、几丁质代谢、活性氧自由基(ROS)代谢、脂质过氧化、免疫、神经反应调控、贝壳生物矿化等密切相关(表5)。其中蛋白醌鞣化、几丁质代谢过程、贝类生物矿化作用与褐色沉积物质形成密切相关，神经反应调控与褐色沉积症部位外套膜萎缩有关，ROS代谢、脂质过氧化、免疫可能与扇贝死亡相关。
黄蛋白家族基因(protein yellow-like)、酪氨酸酶基因(tyr-3)、二乙酰壳二糖酶基因(chitobiase)热休克蛋白70基因(HSP70)、双氧化物酶成熟因子基因(DUOXA1)、多烯脂肪酸异构酶基因(PFI)、Na+/Cl+依赖的甘氨酸转运蛋白基因(GlyT1)、Toll样受体基因等关键基因广泛参与了蛋白醌鞣化、几丁质代谢、活性氧自由基代谢、脂质过氧化、谷胱甘肽代谢、免疫防护、神经反应调控等过程，与褐色沉积症形成密切相关。类咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(CCOAOMT-L)、类1-氨基环丙烷-1羧酸合酶基因(ACCS-L)表达差异最显著，研究表明咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶和1-氨基环丙烷-1羧酸合酶是植物木质素合成和乙烯合成的关键酶[20-21]，但在动物体内的功能并不明确，分析可能参与甲基化、谷胱甘肽代谢和机体免疫等生理活动。另有一些基因编码前列腺素还原酶、CD133、CD109、膜金属内肽酶等，在人体内与肿瘤、血管类疾病、神经类疾病密切相关，但在无脊椎动物中的作用也不明确，推测与虾夷扇贝褐色沉积症的形成及扇贝死亡关联性很高。
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图2 差异表达基因GO功能分类*表示差异表达基因显著富集GO. Fig. 2 GO functional classification of differentially expressed genes* represents the significantly enriched GO of differentially expressed genes. |
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图3 差异表达基因KEGG富集分析 Fig. 3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes |
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表5 前40个差异表达基因功能注释 Tab. 5 Functional annotations of different expressed genes (top 40) |
为验证褐色沉积症组和健康组外套膜转录组测序可靠性，通过qRT-PCR验证患病组和健康组扇贝外套膜6个差异表达基因LOC110459823 (CCOAOMT-L)、LOC110462248 (ACCS-L)、LOC110445682 (uncharacterized gene)、LOC110457068 (Protein yellow-like)、LOC110456245 (DUOXA1)、LOC110450809 (HSP70)的表达结果，并与转录组测序结果进行比较。结果表明，6个随机选择的差异表达基因在qRT-PCR中表达趋势与转录组分析表达结果基本一致(图4)，表明患病组和健康组扇贝外套膜转录组测序结果可靠。
03-0284-13-F004.jpg "点击查看原图") |
图4 应用实时荧光定量RT-PCR与转录组对6个差异基因差异倍数的比较分析1. 类咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因；2. 类1-氨基环丙烷-1羧酸合酶基因；3. 未知基因；4. 黄蛋白家族基因；5. 过氧化物酶成熟因子基因；6. 热休克蛋白70基因. Fig. 4 Comparative analysis of six DEGs by qRT-PCR and transcriptome1. CCOAOMT-L; 2. ACCS-L; 3. vncharacterized gene; 4. protein yellow-like; 5. DUAOX1; 6. HSP70. |
“褐色沉积症”虾夷扇贝贝壳内侧沉积物质呈薄片状，初期颜色偏黄，严重时为褐色。经红外光谱分析主要成分为蛋白质[14]，这种硬化蛋白的形成可能与蛋白质醌糅化相关。醌鞣化是复杂的蛋白质变性反应，角质层中N-乙酰多巴胺(N-acetyldopamine, NADA)和N-β-丙酰多巴胺(N-β- alanyldopamine, NBAD)在二酚氧化酶作用下形成相应酚类物质，这些酚类化合物、蛋白质和几丁质则进一步形成相互作用联结成高度稳定网状结构[22]。昆虫蜕皮和变态发育过程中的表皮黑化和硬化反应是最为常见的蛋白醌糅化反应[23]。
对褐色沉积症和对照组外套膜进行转录组测序，发现编码酪氨酸酶和Yellow蛋白的基因显著上调。酪氨酸酶是醌鞣化过程中的硬化和黑化的关键酶，在蛋白质醌鞣化过程，能催化一元酚和邻酚羟基化[23]，并把二酚氧化成醌，与蛋白、几丁质相互作用交联在一起形成角质[24]，酪氨酸酶是昆虫中唯一参与角质硬化的酶[25]；同时酪氨酸酶在黑色素生成及调控过程中也发挥了重要功能[26-27], Sun等[4]、Yu等[5]发现其在贝类生物矿化和贝类色素沉积过程中显著上调。而yellow基因首次在双壳贝类中发现与褐色沉积物质形成密切相关。yellow基因最早在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)成虫表皮和幼虫口器的异常黄色表型中被鉴别[28-29]，它们编码的蛋白都具有一个王浆主蛋白(major royal jelly protein, MRJP)结构域，因此，MRJP蛋白家族与Yellow蛋白基因家族同源，而且可能由后者进化而来[30]。yellow基因一开始在非昆虫的真核生物均未发现[31-32]，随着全基因组序列数据库的逐渐完善，虾夷扇贝、欧洲大扇贝(Pecten maximus)、黑鲍(Haliotis rubra)、红鲍螺(Haliotis rufescens)等双壳贝类也发现了类似的预测蛋白，但功能尚未明确。而昆虫的yellow基因功能研究较多，其编码的Yellow蛋白在色素形成、黑化(免疫反应)[33]和蛋白质鞣化反应中[22]中发挥重要作用。
褐色沉积物质与昆虫变硬黑化的表皮外观上相似，结合转录组测序与蛋白质醌鞣化相关的显著上调差异表达基因，分析虾夷扇贝贝壳内侧的褐色沉积物质很可能是蛋白质醌鞣化的产物。但蛋白质醌鞣化代谢通路比较复杂，涉及多巴(DOPA)、NADA、NBAD、酪氨酸羟化酶等多个关键物质，此次转录组测序仅发现编码酪氨酸酶和yellow蛋白的基因显著上调，褐色沉积物质与蛋白质醌鞣化的关系有待进一步深入研究。
3.2 褐色沉积症与几丁质代谢及贝壳生物矿化高通量测序技术的应用已发现包括Nacrein蛋白、MSI60蛋白、Prismalin-14蛋白、PIF蛋白等贝类基质蛋白，几丁质等多糖类均与贝类生物矿化密切相关，在贝类形成过程中起重要调控作用[4,34]。褐色沉积症和对照组虾夷扇贝外套膜转录组测序结果发现编码PIF蛋白和非组织特异性碱性磷酸酶等基因上调表达，说明褐色沉积症的形成与贝壳生物矿化有一定关系。但外套膜作为贝壳形成的主要组织，其在本研究中显著上调表达的前40个基因参与贝壳生物矿化仅有2个，这可能与褐色沉积症发病位置主要在外套膜边缘有关，而边缘区的作用是负责分泌贝壳角质层以及棱柱层初始的成核过程[35]，角质层和棱柱层初始成核过程中相关贝壳基质蛋白等参与相对较少。
贝壳角质层主要成分为蛋白质醌鞣化形成的硬蛋白[36-37]，同时还包括黏多糖、脂类等物质[38]，某些双壳贝类的角质层中还含有几丁质[39]。差异表达基因的GO富集分析发现，显著富集的通路均与几丁质代谢相关。编码二乙酰壳二糖酶、壳三糖酶-1、推测β-氨基乙糖苷酶等与几丁质代谢密切相关的蛋白的基因也显著上调。说明褐色沉积物质的形成与贝壳生物矿化过程中的角质层形成及几丁质代谢有密切关系。进一步推测褐色沉积物质也许就是贝壳的角质层，但健康扇贝的角质层在贝壳最外层，而褐色沉积物质沉积在贝壳内侧，其形成原因还需要进一步分析。
3.3 褐色沉积症与ROS代谢、脂质过氧化及谷胱甘肽代谢活性氧(ROS)是氧直接或间接转变的氧自由基及其衍生物，正常代谢时ROS是吞噬细胞发挥吞噬和杀伤作用的主要介质。但是在病理条件下，活性氧浓度超过生理限度时就会损伤生物大分子，其中就包括脂质过氧化、DNA的氧化损伤等，从而导致各种疾病发生[40]。本研究发现过氧化物酶成熟因子、双氧化酶、含铜胺氧化酶等促进ROS代谢的基因显著上调，说明患病虾夷扇贝组织内ROS可能过量。多烯脂肪酸异构酶是不饱和脂肪酸氧化代谢的关键物质之一[41]，其表达上调揭示了患病虾夷扇贝体内出现了脂质过氧化作用。相关研究表明，脂质过氧化作用与机体衰老、癌症、溶血与贫血、炎症反应等密切相关[42]。所以，与ROS过量及脂质过氧化作用相关基因的上调表达，揭示感染褐色沉积症的虾夷扇贝发生死亡可能与ROS过量及引起的脂质过氧化反应对机体造成的损伤相关。ROS过量表达的原因与褐色沉积症形成的原因相似，都有可能是极端环境刺激或病原微生物感染导致。
谷胱甘肽能够保护DNA、蛋白质和其他生物分子抵抗氧化损伤[43]，因此谷胱甘肽对于ROS过量表达和脂质过氧化能够起到防御作用[42]。本研究与谷胱甘肽相关KEGG富集通路显著富集和相关基因的上调表达也证明了这点。显著上调的CCOAOMT-L基因编码类咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶，以S-腺苷甲硫氨酸为底物甲基化生成S-腺苷半胱氨酸，继而生成谷胱甘肽[44]; γ-谷氨酰转肽酶是生物体内谷胱甘肽代谢的相关酶之一，也是反应生物体代谢的一个重要指标[45]; ACCS-L基因编码的类1-氨基环丙烷-1羧酸合酶，是植物乙烯合成的关键酶，催化S-腺苷甲硫氨酸生成乙烯，而乙烯参与了植物生长、发育等多个过程[21]。有研究发现乙烯可以作为人类炎症的早期标记物[46]。但乙烯在贝类体内有无合成，ACCS-L基因显著上调表达但其在褐色沉积症形成过程发挥的作用是否与在植物体内的相同，还需要进一步研究。
3.4 褐色沉积症与神经反应调控、其他免疫因子及疾病虾夷扇贝褐色沉积症部位外套膜除颜色异常症状外，还有一典型特点，即外套膜在褐色沉积部位萎缩而同一贝壳其他部位则正常外伸。研究发现编码Na+/Cl+依赖的甘氨酸转运蛋白、生电碳酸氢钠协同转运蛋白、室管膜相关蛋白和接触蛋白等4个蛋白的差异基因显著上调，功能注释分析发现它们与神经调控密切相关。Na+/Cl+依赖的甘氨酸转运蛋白主要参与神经递质的重摄取跨膜转运，维持突触间隙和细胞外神经递质的低浓度水平，其功能失调与许多神经性疾病相关[47]；生电碳酸氢钠协同转运蛋白对碳酸氢根高度敏感，是细胞内外和突触pH的主要调节剂，调节神经元兴奋性[48]；室管膜相关蛋白可能为一类新的抗细胞黏附分子，在神经再生、分化、细胞迁移及建立特异的细胞联系中起关键作用[49]；而接触蛋白是免疫球蛋白超级家族接触蛋白亚组的一员，定位于细胞膜和细胞质，其主要功能是通过促进神经轴突的推进导向作用进而参与神经系统调节[50]。褐色沉积症部位外套膜萎缩可能与这些基因表达上调有关。
患病组和对照组外套膜转录组测序差异表达显著上调的前40个基因中，与免疫及疾病相关的基因注释结果最多。编码热休克蛋白家族基因广泛参与了内质网相关蛋白质降解、剪切子、细胞内吞等多个KEGG富集通路，编码HSP70蛋白基因的显著上调也反映了其在扇贝体内发挥了分子伴侣功能，增强细胞对损害的抵抗及加速异常蛋白质的降解[51]。丝氨酸蛋白酶抑制剂、Toll样受体、碱性磷酸酶和C型凝集素12作为典型免疫因子在无脊椎动物免疫反应中发挥重要作用[52-55]，编码这些基因的显著上调揭示了扇贝机体对于褐色沉积症的免疫反应。
前列腺素还原酶可以调节内源性脂质介质的代谢过程，是潜在的癌症早期检测生物指标和治疗癌症的标靶分子[56]；中性大氨基酸分子转运载体小亚基是一种不依赖于Na+和pH的跨膜转运蛋白，在哺乳动物中与肿瘤、中枢神经系统性疾病相关[57]; Prominin-1 (CD133)、CD109抗原、膜金属内肽酶等在人体内也与肿瘤、皮肤病、心力衰竭、心血管疾病和阿尔兹海默症等有关[58-60]。编码这些蛋白的基因在虾夷扇贝褐色沉积症外套膜显著上调表达，揭示了这些基因也许也可以作为褐色沉积症的分子标记物，可为下一步病害预警预报提供关键分析指标。
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