2023, Vol. 30 
2. 上海海洋大学，水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306
3. 上海海洋大学，国家海洋生物科学国际联合研究中心，上海 201306
2. Aquatic Animal Genetic Breeding Center Shanghai Collaborative Innovation Center, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
3. International Research Center for Marine Biosciences, Ministry of Science and Technology; Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Forkhead box L3 (foxl3)是FOX (Forkhead box)转录因子超家族的成员，该家族在调控细胞发育、代谢、凋亡、增殖以及分化等方面具有重要作用[1-2]。根据DNA结合区的氨基酸序列，该家族可分为A-S几个亚家族[3]。其中Forkhead box L2 (foxl2)是这个家族的重要成员，是芳香化酶启动子的上游调控因子，参与卵巢的分化和功能的维持[4]。在许多硬骨鱼类中，foxl2有2个旁系同源基因，foxl2a (foxl2)和 foxl2b (foxl3)，这两个旁系同源基因被认为是鱼类特有的两个副本，在性别分化和性腺发育的调控中发挥着重要作用[5]。
关于foxl2的研究开展得比较多，如常见的青鳉(Oryzias latipes)[6]、斑马鱼(Danio rerio)[7]、虹鳟(Onchorhynchus mykiss)[8]、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)[9]、网纹石斑鱼(Epinephelus merra)[10]以及牙鲆(Paralichthys olivaceus)[11]等。foxl2主要通过脑–垂体–性腺轴来发挥作用，是目前发现的脊椎动物卵巢决定和分化的最早标志性启动因子[12]。在青鳉中研究证实，foxl3作为一个开关基因，参与了由rec8a (减数分裂重组蛋白a)和fbxo47 (F-box蛋白47)调节的两条独立的卵子发生途径，从而调节卵泡的生成[13-14]。Dai等[15]通过对尼罗罗非鱼转录组测序表明，foxl3在雌性罗非鱼孵化后30 d的卵巢中表达最高，在精巢中不表达。但在其他许多鱼类物种中，foxl3则在精巢中的表达高于在卵巢中的表达，例如大西洋鲑(Salmo salar)[16]、欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)[17]、黄鳝(Monopterus albus)[18]等。在黄鳝性逆转过程中，foxl3在性腺中表达量逐渐升高，但在精巢中的表达水平显著高于卵巢中[18]。研究发现在日本鳗鲡(Anguilla japonica)中，foxl3在雄性中的表达显著高于雌性，表明 foxl3可能在其性别决定中起着重要的作用[19]。这些结果表明，在硬骨鱼类中foxl3的表达模式和功能存在较大差异。研究表明，foxl3可能在硬骨鱼类卵母细胞减数分裂的起始阶段发挥作用，或者在精巢发育后期和精巢成熟过程中调节雄性特异性基因[20-21]。总之，foxl2在很多鱼类中已被研究，而foxl3在鱼类性别分化与发育中的功能，目前仍需要进一步研究[5]。
牙鲆又称“左口鱼”、“比目鱼”，隶属鲽形目，是一种广泛分布于亚洲海岸的海水经济鱼类，其肉质细腻鲜美，营养价值丰富。在其生长发育过程中，雌鱼生长较快，个体明显大于雄鱼[22-23]。因此，研究牙鲆的性腺分化与发育机制具有重要的意义。本研究通过PCR克隆和测序确认了牙鲆foxl3的cDNA序列，通过生物信息学分析了其分子特征和系统进化，通过实时荧光定量PCR技术研究了该基因在牙鲆各个组织的分布情况，应用亚细胞定位技术对其进行了定位分析，以期为进一步深入探讨foxl3在牙鲆性腺中的作用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料本实验所用牙鲆成鱼[(体重660±50) g]采购于上海江杨水产市场。无菌环境下解剖获得牙鲆脑、心脏、肾脏、肝脏、胃、肌肉、精巢、卵巢、鳃和肠组织，经焦碳酸二乙酯(DEPC)水冲洗干净，在TRizol中匀浆提取总RNA。
1.2 方法 1.2.1 RNA的提取与cDNA的合成用TRizol法进行牙鲆各组织总RNA的提取，分别用 NanoDrop 2000C (Theemo Scientific，美国)和1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量和完整性。用 PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒(全式金，中国)反转录合成 cDNA的第一条链。将cDNA稀释5倍置于–20 ℃保存。
1.2.2 牙鲆foxl3的分子克隆通过查询NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得了预测的牙鲆foxl3 cDNA 序列(XM_020083018.1)，该cDNA序列包括完整的开放阅读框(open reanding frame, ORF)和部分3ʹ非编码区(untranslated region, UTR)。根据查询的cDNA序列，设计2对特异性引物来进行PCR扩增并测序(表1)。
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表1 实验所用引物序列 Tab. 1 Primers used in this study |
用DNAMAN软件对克隆测序获得的cDNA序列进行比对与拼接，通过ExPASy-ProtParam (https://web.expasy.org/ protparam/)在线分析牙鲆Foxl3的理化性质、疏水性和等电点等；利用SMART (http://smart.embl- heidelberg.de/)网站在线预测其蛋白质二级结构、SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)预测三级结构；利用MEGA5.1进行多序列比对，使用NJ邻接法构建系统进化树。
1.2.4 pmir-pEGFP-N1-Foxl3载体构建利用EcoR I限制性内切酶对真核表达载体pEGFP-N1 (Promega，美国)进行酶切，使用诺唯赞网站设计带有酶切位点和同源臂的特异性引物(表1)，进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测得到目的条带。利用无缝克隆将目的片段与酶切后pEGFP- N1载体进行连接并转化，得到重组质粒pmir- pEGFP-N1-foxl3，以含卡那霉素的LB培养基进行抗性筛选，经菌液PCR鉴定无误后，将菌液送至苏州安升达公司测序。测序无突变后进行扩大培养，按照质粒提取试剂盒(Omega，美国)说明书对重组质粒进行提取，同时对重组质粒进行酶切验证。
1.2.5 细胞培养及转染HEK-293T细胞(人类胚胎肾细胞)来自本实验室储存，培养于37 ℃, 5% CO2培养箱中。提前将生长状态良好的293T细胞均匀铺置在6孔板中，待细胞密度达到80%左右时，使用LipfectamineTM 3000 reagent 转染试剂(Invitrogen，美国)将上述重组质粒pmir- pEGFP-N1-foxl3转染进293T细胞中，做好标记放回培养箱中继续培养。
1.2.6 Foxl3亚细胞定位待转染36 h之后，吸出孔板中原有的培养基，并用PBS轻轻洗涤细胞3次；室温下，用预冷的4%多聚甲醛固定20 min；弃去多聚甲醛，用PBS洗涤3×2 min，加入DAPI静置10 min；吸除DAPI再以PBS洗涤细胞3次，每次10 min，并通过荧光倒置显微镜(OLYMPUS，日本)观察。
1.2.7 foxl3表达分析根据获得的foxl3 cDNA序列，利用Prime 5.0 设计牙鲆foxl3和内参基因18S的定量引物(表1)。首先通过Bio-Rad CFX96荧光定量仪绘制关于牙鲆foxl3和内参基因18S的标准曲线，当扩增效率在90%至110%范围内，进行定量检测。反应体系(20 μL)为：2×ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix 10 μL，上游引物和下游引物各0.4 μL, cDNA 1 μL, RNase-free water 8.2 μL。反应条件为：95 ℃ 3 min, 95 ℃ 5 s, 57 ℃ 30 s, 40 个循环，65~ 95 ℃每个循环增加0.5 ℃需5 s。每个样品设置3个技术重复和3个生物学重复，荧光定量数据用2–ΔΔCt 法来计算。
1.2.8 数据统计分析所有数据均表示为平均值±标准误($\bar{x}\pm \text{SE}$)，采用 SPSS 19.0进行统计学分析，用GraphPad Prism 7软件进行作图，P<0.05时视为差异显著。
2 结果与分析 2.1 牙鲆foxl3的分子特性与系统进化特征 2.1.1 牙鲆foxl3的序列特征与理化性质经PCR克隆得到牙鲆foxl3编码区(coding sequence, CDS)和3ʹUTR区，共1089 bp，包括750 bp的开放阅读框和289 bp 的3ʹUTR，该序列编码249个氨基酸(Aa)，含20种常见的Aa，其中脯氨酸的含量最高，达到10.4%，其次为丝氨酸、精氨酸和天冬酰胺，含量分别为9.2%、7.6%以及7.2% (图1)。第30~124个Aa是foxl3的结构域，Foxl3蛋白带正电荷(Arg+Lys)的残基总数为28，负电荷(Asp+Glu)的残基总数为24。
ExPASy-ProtParam预测结果显示，Foxl2蛋白分子式为C1518H2323N435O451S20，分子质量为34.52 kD，亲水系数(hydrophilic coefficient)为–0.832，理论等电点(theoretical isoelectric point)达到9.21，不稳定系数(instability coefficient)为64.67。而Foxl3的分子式为C1271H1932N366O375S11，分子质量为28.70 kD，亲水系数(hydrophilic coefficient)为–0.842，理论等电点(theoretical isoelectric point)为8.77，不稳定系数(instability coefficient)为63.85。Foxl2和Foxl3蛋白均属于不稳定酸性疏水蛋白。
Foxl2蛋白二级结构包含1个Forkhead家族(FH superfamily)结构域和3个低复杂功能结构域，而Foxl3蛋白只含有一个FH家族结构域。Foxl2三级结构包含16.34% α螺旋、18.63%的延伸链和65.03%的无规则卷曲；Foxl3三级结构显示其包含20.48% α螺旋、15.26%的延伸链和64.26%的无规则卷曲，不均匀分布在多肽链上(图2)。
2.1.2 牙鲆foxl3的同源性和系统进化将牙鲆的Foxl3氨基酸序列与其他物种进行比对发现，其结构域比较保守(图3)。牙鲆的Foxl3氨基酸序列与大菱鲆(Scophthalmus maximus)的相似性最高，达到91.97%；其次是大黄鱼(Larimichthys crocea)，氨基酸相似性为91.16%，与尼罗罗非鱼、青鳉和半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的氨基酸相似性分别为89.16%、84.34%和83.52%；而与斑马鱼的氨基酸相似性仅为66.27% (表2)。而牙鲆Foxl2与其他硬骨鱼类的氨基酸序列一致性较高，其中与大菱鲆的氨基酸相似性为96.75%，与青鳉的氨基酸相似性为96.41%，与尼罗罗非鱼和黄鳝的氨基酸相似性达到95.75%，与半滑舌鳎的氨基酸相似性为90.55%，而与斑马鱼的氨基酸相似性也达到了81.99% (表2)。
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图1 牙鲆foxl3 cDNA序列及推导的氨基酸序列ATG为翻译起始位点，终止密码子用星号表示. Fig. 1 cDNA sequences and deduced amino acid sequences of foxl3 from Paralichthys olivaceusATG is the translation start site and the stop codon is signed with asterisk. |
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图2 牙鲆Foxl2和Foxl3蛋白二级和三级结构a. 牙鲆Foxl2蛋白的二级和三级结构；b. 牙鲆Foxl3蛋白的二级和三级结构. Fig. 2 Secondary and tertiary structures of Foxl2 and Foxl3 proteins in Paralichthys olivaceusa. Secondary and tertiary structures of Foxl2; b. secondary and tertiary structures of Foxl3. |
比较还发现牙鲆的Foxl3与Foxl2氨基酸相似性较高，达到62.77%。系统进化树分析发现牙鲆Foxl3首先与大菱鲆聚为一类，再与大黄鱼、尼罗罗非鱼、半滑舌鳎、青鳉和斑马鱼这些硬骨鱼类聚集。而牙鲆的Foxl2也是首先与大菱鲆聚为一支，再与青鳉、尼罗罗非鱼、黄鳝、半滑舌鳎和斑马鱼聚为一支，二者分属不同的分支(图4)。
2.2 Foxl3重组真核表达载体的酶切验证提取重组质粒并测其浓度，用限制性内切酶EcoR I对重组质粒pmir-pEGFP-N1-foxl3进行酶切验证，得到线性化质粒(4733 bp)和foxl3基因 cDNA (750 bp)片段，凝胶电泳验证结果显示获得的两条条带符合载体和目的条带大小，表明pmir-pEGFP-N1-foxl3重组质粒构建成功(图5)。
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表2 牙鲆Foxl3和Foxl2与其他物种氨基酸的一致性比较 Tab. 2 The amino acid sequence consistency comparison of Foxl3 and Foxl2 between Paralichthys olivaceus and other species |
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图3 牙鲆Foxl3和其他物种氨基酸序列的比对分析黑色区域代表保守的氨基酸；灰色代表不同物种间的差异氨基酸. Fig. 3 The amino acid sequence alignment of Foxl3 between Paralichthys olivaceus and other speciesThe black areas represent conserved amino acids. Gray represents different amino acids between species. |
04-0406-09-F004.jpg "点击查看原图") |
图4 硬骨鱼类Foxl2和Foxl3蛋白的系统进化树 Fig. 4 Phylogenetic tree of Foxl2 and Foxl3 proteins in teleost fishes |
转染36~48 h后，按照DAPI染色方法处理细胞样品，通过荧光倒置显微镜观察可见HEK- 293T细胞中EGFP蛋白为绿色，细胞核呈蓝色，两者蛋白的荧光不完全重合，因此EGFP蛋白定位在细胞核和细胞质中；而融合蛋白EGFP-foxl3的荧光与细胞核也不完全重合，即定位在细胞质和细胞核中(图6)。
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图5 重组质粒的酶切验证结果M: 15000 DNA Marker. Fig. 5 Digestion verification of recombinant plasmidM: 15000 DNA Marker. |
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图6 Foxl3蛋白的亚细胞定位观察 Fig. 6 Subcellular localization observation of Foxl3 protein |
实时荧光定量PCR结果显示，foxl3在牙鲆成体的精巢、卵巢、脑、心脏、肝脏、肾脏、胃、鳃、肠和肌肉中均有表达，但在不同组织中的表达量差异较大，其中在卵巢中的表达量最高，显著高于精巢以及其他组织(P<0.05)(图7)。
3 讨论2004年，Baron等[20]在虹鳟中发现了不同于foxl2的基因，该基因的叉头区域属于L2，猜测可能是foxl2的旁系同源基因，命名为foxl2b，又称为foxl3。然而，由于进化的原因，foxl3在真兽亚纲动物中消失，两个副本基因在硬骨鱼类中保留，可以说foxl3作为鱼类特有的基因组副本而存在[5,24]。在哺乳动物等高等脊椎动物中，foxl2 可能已经取代了鱼类和其他低等脊椎动物中foxl2和foxl3的功能[25]。其中foxl2通常被认为是卵巢分化的标志基因，其表达与芳香化酶一致，芳香化酶是产生雌激素的关键，而雄激素或者芳香化酶抑制剂能够下调雌性个体foxl2和foxl3的表达[4,26]。
04-0406-09-F007.jpg "点击查看原图") |
图7 牙鲆foxl3基因的组织表达Br：脑；Li：肝脏；St：胃；Ki肾脏；He：心脏；Mu：肌肉；Gi：鳃；In：肠；Te：精巢；Ov：卵巢.不同字母表示差异显著(P<0.05). Fig. 7 The expression of foxl3 gene in different tissues of Paralichthys olivaceusBr: Brain; Li: Liver; St: Stoamch; Ki: Kidney; He: Heart; Mu: Muscle; Gi: gill; In: intestines; Te: Testis; Ov: Ovary. Different letters indicate significant difference (P<0.05). |
本研究通过PCR克隆技术鉴定了牙鲆foxl3基因，该基因全长1089 bp，开放阅读框750 bp，编码249个氨基酸，其中脯氨酸含量最高。脯氨酸是构成蛋白质的20种氨基酸中唯一的亚氨基酸，在蛋白质合成、创造健康细胞、代谢等方面发挥重要的作用。此外，脯氨酸还是细胞内的一个关键的调节因子，参与多种生理和生化过程[27]。作为FOX家族的成员，Foxl3与Foxl2结构相似，都包含1个FH家族功能结构域，此结构域广泛存在于各种真核生物细胞中。FH蛋白在细胞极性化、细胞分裂、细胞链接和黏附等方面发挥着重要作用。
系统进化树表明牙鲆Foxl3与大菱鲆、大黄鱼等硬骨鱼类聚为一支，其中与大菱鲆的亲缘关系最近，与Foxl2不属于同一分支。通过氨基酸序列比对分析发现，Foxl3的结构域比较保守，但综合来看，牙鲆Foxl2比Foxl3更保守，这与Cocquet[28]认为Foxl2在进化过程中的作用相对保守的观点是一致的。与Foxl2蛋白相比，牙鲆Foxl3蛋白序列明显缺少部分片段，表明Foxl3在不同物种之间差异显著，进化速度是非常快的。foxl2和foxl3之间的差异与鱼类中许多其他的旁系同源基因的高度保守形成明显的对比[29]。造成这一现象的原因可能是因为副本基因foxl3功能的退化，但是也可能是foxl3在进化过程中获得了新的功能[20]。
3.2 foxl3在鱼类中的表达分布foxl2和foxl3作为旁系同源基因被认为是在硬骨鱼类中所特有并且在硬骨鱼类的性腺发育中起着重要作用。研究发现，foxl3在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)精巢中的表达量显著高于卵巢等其他组织，通过调节rec8或fbxo47的表达在精巢发育中起决定性作用[30-31]。在处于自然性逆转的黄鳝性腺中，foxl3在精巢中的表达水平几乎是卵巢的40倍[18]。但在青鳉中，foxl3在卵巢的生殖细胞中高表达，通过调节卵巢中减数分裂的进程，抑制卵巢中精子的发生并促进卵泡的发育[14,32]。在尼罗罗非鱼中，通过原位杂交发现foxl3 mRNA主要定位于卵巢卵原细胞中，在精巢组织中则检测不到其表达[15]。同样，在虹鳟中，foxl3在发育中的卵巢中高表达，而在精巢中几乎检测不到foxl3的表达[20]。而本研究与青鳉、尼罗罗非鱼和虹鳟的研究结果较为一致，foxl3在牙鲆卵巢中的表达量显著高于精巢等其他组织，呈现出明显的雌雄性别二态性。亚细胞定位结果进一步表明Foxl3细胞融合蛋白在细胞核和细胞质中表达，为后续探讨foxl3在牙鲆性腺中的定位表达与功能研究提供了理论依据。
4 结论本研究明确了牙鲆foxl3的cDNA序列，并对其分子特征和系统发育进行了分析。亚细胞定位显示Foxl3在细胞核和细胞质中表达，实时荧光定量PCR分析表明该基因主要在牙鲆的性腺组织中表达，但呈现了明显的雌雄性别二态性，暗示了foxl3可能在牙鲆的卵巢发育和分化过程中起着重要作用。
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