2023, Vol. 30 
2. 上海海洋大学，水产种质资源发掘与利用省部共建教育部重点实验室，上海 201306
2 Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
日本鳗鲡(Anguilla japonica)是一种具有重要经济价值的降海洄游型鱼类，产卵场位于西马里亚纳海脊附近[1]，孵化的柳叶鳗仔鱼随北赤道洋流和黑潮暖流漂至中国、日本、韩国的等大陆架海域变态成玻璃鳗，并在河口变态成线鳗[2]。这种复杂的生活史特性，使得人工育苗困难重重，如无法完全模拟出鳗苗生长的环境，未能找到合适的饵料等[3]，目前养殖所用的鳗苗完全依赖于天然捕捞[4]。近年来，我国学者对日本鳗鲡的研究主要集中在鳗苗的资源动态[5-6]、早期生活史特征[7]、发育时相[8]等方面。但对日本鳗鲡幼体的肠道微生物的研究却鲜有报道。
肠道是鱼类消化食物和吸收营养的器官。鱼类肠道微生物中的细菌种类主要是在肠道中能够生存的来自环境或者饵料的菌群[9]，其与宿主以及所处的水环境形成相互依赖、相互制约的微生态体系，与鱼类的生长发育、营养吸收与代谢、免疫等诸多生理生化功能息息相关[10-12]。鱼类孵化以后，环境和饵料是影响肠道微生物的主要因素[13]。Zhu等[14]研究了日本千叶山养殖的日本鳗鲡成体的肠道微生物，发现鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、黄杆菌属(Flavobacterium)、红杆菌属(Rhodobacterales)在生物素代谢和脂肪酸合成代谢过程中起关键作用。刘海姿等[15]研究发现投喂开口配合饵料相比投喂红虫的美洲鳗(Anguilla rostrata)白仔苗肠道中的益生菌增加。因此，分析鱼类肠道微生物的组成，有助于了解鱼类生长环境的特征及其生理特点，对野生资源的管理和养殖利用具有重要意义。随着测序技术的快速发展，基于16S rRNA 扩增子测序的高通量测序技术逐渐成为微生物群落结构研究的主要手段[16]，其最大的优势是对微生物菌群种类和数量可以精确解析[17]，该技术已被广泛应用于肠道微生物的研究[18-19]。
长江口是日本鳗鲡幼体溯河洄游的必经通路，本实验以2022年日本鳗鲡洄游汛期在长江口南汇东滩外侧获取的日本鳗鲡幼体为研究对象，对V3~V4区进行16S rRNA扩增子测序，首次研究长江口日本鳗鲡幼体肠道微生物的结构特征和潜在功能，并分析不同月份间日本鳗鲡幼体肠道菌群之间的差异性，研究日本鳗鲡幼体微环境稳态，为其苗种繁育及饵料研制提供参考。
1 材料和方法 1.1 样本的采集与处理采样点位于长江口南槽航道内侧、南汇东滩外侧，水深在6.5~8.5 m，布网范围为30°48′00″N~ 30°53′00″N, 122°03′10″E~122°03′40″E (图1)。在2022年1—4月的日本鳗鲡幼体汛期，温度范围为7.5~15.0 ℃，利用长江口常用的日本鳗鲡幼体捕捞张网–单桩框架定置张网逐月采集日本鳗鲡幼体，每月中旬在船上随机抽取约100尾样本放入双层密封袋，立即在–20 ℃的冰箱中冷冻保存。
06-0699-12-F001.jpg "点击查看原图") |
图1 长江口日本鳗鲡幼体样本的采集区域 Fig. 1 Sampling area of Anguilla japonica larvae collected in the Yangtze River Estuary |
短暂冷冻保存后的样本送到实验室后解冻，用吸水纸吸去水分。用游标卡尺测量全长(total length, TL)，精确至0.01 mm；用电子天平称量体重(body weight, BW)，精确至0.1 mg。随后用体视显微镜观察每尾样本的体表色素分布，依据郭宏艺等[8]对玻璃鳗体表色素发育过程的评判标准来判断发育时期，总体日本鳗鲡幼体包括VA、VB和VIA1期3个发育阶段，VIA1期日本鳗鲡幼体较少，只存在于4月。每月随机挑选VA期和VB期各10尾作为肠道微生物分析的样本。用无菌水清洗鱼体表面，在无菌环境下剪除头部和尾部，保留躯干部作为分析材料。每月的VA期或VB期10尾鱼的躯干部合在一起，作为一个分析样本。在测序前放入1个5 mL离心管中，在–80 ℃冰箱里保存。每个月有2个不同发育时期的肠道微生物测序样本，供保存8个样本，其生物学信息见表1。
1.2 DNA的提取和肠道微生物多样性的测定采用磁珠法(QJ磁珠DNA提取试剂盒)提取鱼类肠道样本的DNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳，并用Nanodrop 2000对DNA的浓度和OD260/OD280值进行测定，浓度和质量合格的样本由上海美吉生物医药科技有限公司完成16S rRNA基因扩增并测序。
采用338F (5′–ACTCCTACGGGAGGCAGCA–3′)和806R (5′–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3′)通用引物对DNA样本中的16S rRNA基因V3~V4区域进行PCR扩增。20 μL PCR反应体系为：10 μL 2×Pro Taq，引物338F (5 mmol/L)和引物806R (5 mmol/L)各0.8 μL, 10 ng DNA模板，然后用ddH2O补足20 μL。PCR过程：95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 29个循环；最后72 ℃延伸10 min。使用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切割回收。结果表明，产物目的条带大小正确，浓度合适，可进行后续实验。使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN 公司)切胶回收PCR产物，将PCR产物用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。使用Illumina测序专用的TruSeqTM DNA Sample Prep Kit试剂盒建立基因文库。构建好的文库通过Illumina Miseq PE300平台进行高通量测序。
|
表1 长江口日本鳗鲡幼体的色素发育时期、全长、体重 Tab. 1 The pigmentation stages, total length and body weight of Anguilla japonica larvae in the Yangtze River Estuary |
Miseq测序得到双端序列数据(reads)，根据PE reads之间的overlap关系，使用Trimmomatic、FLASH软件将成对的reads经过质控、拼接、过滤、去重、矫正序列方向等优化数据，再采用Usearch (version 7.1 http://drive5.com/uparse/)软件对所得序列进行处理，并根据97%相似度水平对序列进行操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)聚类。采用RDP classifier贝叶斯算法对在97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。利用QIIME软件将其与silva (Release128 http://www.arb-silva.de)数据库在不同分类水平上进行比对和注释，从而获得每个OTU所对应的物种分类信息。
1.3.2 Alpha多样性采用Sobs指数、Chao1指数(Schao1)[20]和ACE指数(Sace)[21]计算菌群丰度，Simpson优势度指数(D)[21]和Shannon-Wiener多样性指数(Hʹ)[22]计算菌群多样性状况，覆盖率指数(coverage, C)[23]度量测序深度。公式如下：
| ${S_{{\rm{obs}}}} = {\rm{实际测量出的OTU数}}$ | (1) |
| ${S_{{\rm{chao1}}}} = {S_{{\rm{obs}}}}\frac{{{n_1}({n_1} - 1)}}{{2({n_2} + 1)}}$ | (2) |
| ${S_{{\rm{ace}}}} = {S_{{\rm{abund}}}} + \frac{{{S_{{\rm{rare }}}}}}{{{C_{ace}}}} + \frac{{{n_1}}}{{{C_{{\rm{ace}}}}}}\gamma _{{\rm{ace}}}^2$ | (3) |
| ${D_{{\rm{simpson}}}} = \frac{{\sum\limits_{i = 1}^{{S_{{\rm{obs}}}}} {{n_i}} \left( {{n_i} - 1} \right)}}{{N\left( {N - 1} \right)}}$ | (4) |
| ${H'_{{\rm{shannon}}}} = - \sum\limits_{i = 1}^{{S_{{\rm{obs}}}}} {\frac{{{n_i}}}{N}} \ln \frac{{{n_i}}}{N}$ | (5) |
| $C = 1 - \frac{{{n_1}}}{N}$ | (6) |
式中，n1为只含有1条序列的OTU数(如singleton), n2为只含有2条序列的OTU数，ni代表含有i条序列的OTU数，N为样本中出现的总序列数；Sabund为含有超过10条序列的OTU数，Srare为含有不多于10条序列的OTU数，Cace表示所有低丰度(出现≤10次)的物种中非Singleton的比例，$\gamma _{ace}^2$为变异系数。
1.3.3 统计分析使用ArcGIS10.3软件绘制采样点分布图。使用R3.3.1软件进行物种组成柱状图分析，R语言工具制作稀释性曲线图、成分分析图、韦恩(Venn)图并进行分析。使用Wilcoxon秩和检验来比较各组之间的Alpha多样性指数差异，ANOSIM检验来比较VA期组和VB期组肠道菌群的结构差异，P<0.05表明差异显著。使用PICRUSt菌群代谢功能预测工具对OTU丰度表进行标准化，然后通过每个OTU对应的Green Gene ID，对OTU进行COG和KEGG功能注释，从而获得OTU在COG、KEGG各功能水平的注释信息及各功能在不同样本中的丰度信息。
2 结果与分析 2.1 稀释性曲线经过质控后，8个样本共获得有效序列319967条，平均每个样本39996条。99.9%的序列长度在400~500 bp之间，平均长度为425.99 bp。对所有序列进行97%相似水平聚类后得到1467个OTU。8个样本的coverage值均在99.9%以上，说明序列未被检出的可能性小，测序结果真实可靠。从图2可见，测序数在15000以下时，各样本实际观测到的OTU数(Sobs指数)随着所测序列数的增加而快速增大，也就是日本鳗鲡幼体肠道中有大量菌群被发现；测序数大于25000时，各样本Sobs指数曲线均趋于平缓，说明此时的测序深度足以反映各个样本微生物群落的组成和多样性状况。
06-0699-12-F002.jpg "点击查看原图") |
图2 8个日本鳗鲡幼体的肠道菌群稀释性曲线 Fig. 2 Rarefaction curve of intestinal microbiota of 8 Anguilla japonica larvae |
8个日本鳗鲡幼体肠道微生物样本JVA、JVB、FVA、FVB、MVA、MVB、AVA、AVB测得的OTU数分别为802、996、307、262、330、141、124、207个，平均每个样本396个。从OTU数的花瓣率图(图3)中可以看出，8个样本共有的OTU为44个；样本JVA和JVB的特有OTU数较多，分别为238个和410个；而MVA和MVB较少，分别为9个和0个。
将每月2个不同发育时期的肠道微生物测序结果组合在一起绘制成各月组间的韦恩图(图4)，其中1月组(JV)的OTU数为1339个，2月组(FV)、3月组(MV)和4月组(AV)分别为417个、347个和225个，可见OTU数随月份递增而明显减少，1月组是其他3个月组的3.21~5.96倍。4组共有的OTU数为104个，这个数占JV组的7.77%、FV组的24.94%、MV组的29.97%、AV组的46.22%。1―4月组各自特有的OTU数分别为820个、57个、17个和18个。
06-0699-12-F003.jpg "点击查看原图") |
图3 8个日本鳗鲡幼体肠道菌群样本的OUT分布花瓣图每个花瓣代表一个样本，中间的数字代表所有样本共有的OTU数，花瓣上的数字代表该样本的特有OTU数. Fig. 3 Petal map of OTU distribution of intestinal microbiota community in 8 Anguilla japonica larvaeEach petal represents a sample, and the number in the middle represents the OTU shared by all samples. The number on each petal represents the unique OTU number of the sample. |
06-0699-12-F004.jpg "点击查看原图") |
图4 4个月组日本鳗鲡幼体肠道菌群OTU数的韦恩图 Fig. 4 The Venn diagram of OTUs of intestinal microbiota of Anguilla japonica larvae in 4 month groups |
Sobs、Ace、Chao1指数表征群落中物种的丰富度，Shannon-Wiener和Simpson指数表征群落中物种的多样性。对8个长江口日本鳗鲡幼体肠道微生物样本的OTU数作上述Alpha多样性指数分析，结果发现各个样本间的指数差异较大。样本JVB的Sobs、Ace、Chao1、Shannon值最大，分别为996、1009.24、1020、4.36, Simpson值较小，为0.08，显示该样本的肠道微生物物种最丰富、物种多样性最高。AVA的Sobs、Ace、Chao1值最小，分别为124、145.17、137.64，显示该样本的肠道微生物物种最贫乏。MVB的Shannon值最小，为1.52, Simpson值最大，为0.51，显示该样本的肠道微生物物种多样性最低(图5)。Wilcoxon秩和检验结果也显示，1月组JVA和JVB两个样本的肠道菌群物种多样性均显著高于其他样本(P<0.05)，但不同月份中2个发育时期VA组和VB组的肠道微生物物种丰度和多样性差异并不显著(P>0.05)。
06-0699-12-F005.jpg "点击查看原图") |
图5 长江口日本鳗鲡幼体肠道菌群的各类Alpha多样性指数 Fig. 5 The Alpha diversity indices of intestinal microbiota of Anguilla japonica larvae in the Yangtze River Estuary |
经与silva数据库比对，8个测序样本1467个OTU共鉴定出51门、140纲、286目、414科、643属、959种肠道微生物。其中样本JVB含有的门最多，有49门；样本MVB含有的门最少，仅7门；每个样本平均包含26门。以月组为单位统计，则JV组有51门、FV组有29门、MV组有29门、AV组有19门，平均为32门，呈现出门数随月份递增而明显减少的趋势。以发育时相为单位统计，则VA组有45门、VB有49门，平均为47门。
8个样本合计，变形菌门(Proteobacteria)平均占比为81.24% (61.10%~90.98%)，拟杆菌门(Bacteroidota)平均占比为10.61% (3.30%~38.69%)，其他占比较高的还有厚壁菌门(Firmicutes) (1.87%)、绿弯菌门(Chloroflexi)(1.62%)和放线菌门(Actinobacteriota)(1.51%)。但在不同样品中各门所占丰度存在较大差异，拟杆菌门在样本AVA中占比最高，为38.69%；绿弯菌门和放线菌门在JVA和JVB中占比较高，在JVA中占比为5.10%和5.03%，在JVB中占比为7.16%和4.89% (图6)。
在属水平上，每个样本平均包含229属，最多的JVB样本含有473属，最少的MVB样本仅有90个属。以月组为单位进行统计，则1—4月组分别为596属、251属、229属和152属，平均每组为307属，也呈现出属数随月份递增而明显减少的趋势。以发育时相为单位统计，则VA组有496属、VB有542属，平均为519属。
8个样本合计，长江口日本鳗鲡幼体肠道微生物优势菌群主要由嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属、无色杆菌属(Achromobacter)、希瓦氏菌属(Shewanella)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、弧菌属(Aliivibrio)、不动杆菌属(Acinetobacter)等组成，占比分别为35.10%、16.75%、7.99%、4.82%、4.21%、3.86%、1.92%、1.83% (图7)。其中，嗜冷杆菌属在样本FVB中丰度占比达80.72%；假单胞菌属在样本MVA和MVB中为第一优势菌属，占比分别为36.85%和72.93%；黄杆菌属在样本AVA中为第一优势菌属，占比为38.32%；还有少数属在个别样本中为优势菌群。
2.5 OTU水平的PCoA分析在OTU分类水平上，运用bray_curtis距离算法对8个日本鳗鲡幼体菌群样本进行主成分分析(PCoA)，结果显示主坐标轴PC1、PC2的解释度分别为48.58%和22.06%。图8中1月组和3月组的2个样本分别分布在两个象限中，各自构成一个组群；2月组和4月组的4个样本比较接近，说明这两组肠道微生物群落结构差异较小，与上述Alpha多样性分析的结果相一致。1月组日本鳗鲡幼体肠道微生物丰度和多样性较高，3月组在属水平上与其他月组差异较大。此外，通过ANOSIM检验分析得出，2个发育时期VA组和VB组肠道菌群结构的差异不显著(R=–0.1562, P>0.05)。
06-0699-12-F006.jpg "点击查看原图") |
图6 门水平的8个样本日本鳗鲡幼体肠道菌群组成 Fig. 6 Intestinal microbiota composition of 8 samples of Anguilla japonica larvae at the phylum level |
06-0699-12-F007.jpg "点击查看原图") |
图7 属水平的8个样本日本鳗鲡幼体肠道菌群组成 Fig. 7 Intestinal microbiota composition of 8 samples of Anguilla japonica larvae at the genus level |
06-0699-12-F008.jpg "点击查看原图") |
图8 OTU水平的PCoA分析图 Fig. 8 PCoA analysis chart at OTU level |
用PICRUSt菌群代谢功能预测工具对1467个OTU进行功能注释，在KEGG pathway 1、pathway 2和pathway 3水平上，分别有7个、41个和304个代谢功能途径。统计显示，在KEGG pathway1水平上由OTU编码的基因中，有50.62%与新陈代谢相关，15.26%与遗传信息处理相关，13.86%与环境信息处理相关，此外有较少的OUT编码的基因与细胞进程、人类疾病和有机系统相关，分别占比为3.53%、1.31%和0.79% (表2)。
对OTU进行COG功能注释，获得的OTU在COG功能水平上的注释信息及各功能在不同样本中的相对丰度信息如图9所示：菌群编码的基因中与新陈代谢功能相关的主要有氨基酸转运与代谢(E，占比9.63%)、无机离子运输和代谢(P, 6.47%)、脂质代谢(I, 4.73%)及碳水化合物运输和代谢(G, 4.67%)等；与遗传信息处理相关的主要有转录(K, 6.54%)及复制、重组和修复(L, 5.44%)；与环境信息处理相关的主要有能源生产和转换(C, 7.20%)及信号转导机制(T, 5.20%)。
3 讨论 3.1 长江口日本鳗鲡幼体肠道菌群的多样性和丰度黄丽丽等[24]分析了新疆3种冷水性肉食鱼类哲罗鱼(Hucho taimen)、细鳞鱼(Qinling lenok)和黑斑狗鱼(Esox reicherti)肠道微生物群落结构，观测到OTU总数为242个，包含17门。肖善势等[25]分析了3种肉食性鱼类翘嘴鲌(Culter alburnus)、达氏鲌(C. dabryi)和红鳍原鲌(Cultrichthys erythropterus)肠道微生物群落结构，观测到的OTU数分别为407、666和392个，合计1094个OTU包含23门。Wu等[26]分析了湖北荆州养殖草鱼(Ctenopharyngodon idella)肠道微生物菌群结构，观察到6058个OTU，包含25门。由此可见，肉食性鱼类肠道微生物的OTU数较草食性鱼类的少，但在门水平上差异不大。本研究在8个日本鳗鲡幼体肠道组织样本中发现的OTU总数为1467个，共鉴定出51个门，OTU数处于肉食性和草食性鱼类之间，但门的数量明显高于上述研究结果，也高于养殖欧洲鳗(Anguilla anguilla)的OTU数(758个)[27]。但不同样本所包含的OTU数(141~996个)和门数(7~49个)差异也很大，每样本平均包含396个OTU和26门，并表现出随月份递增而明显减少的现象。
|
|
表2 KEGG pathway 1代谢通路统计 Tab. 2 Metabolic pathway statistics based on KEGG pathway 1 |
06-0699-12-F009.jpg "点击查看原图") |
图9 长江口日本鳗鲡幼体肠道菌群的COG功能分类统计 Fig. 9 The COG function classification of intestinal microbiota in Japanese eel larvae in the Yangtze River Estuary |
Alpha多样性分析也显示，1月组两个样本的Sobs指数、ACE指数、Chao1指数和Shannon指数均显著高于其他月组(P<0.05)，表明微生物物种丰度和多样性更高。但2个发育时期VA组和VB组的肠道微生物物种丰度和多样性差异并不显著(P>0.05)。研究表明，鱼类肠道微生物群落结构和多样性与其生长情况、生存环境以及食性等均有关[28]。长江口日本鳗鲡幼体的日龄范围为(122.0~190.0) d，平均(150.9±12.7) d，孵化时间一般在8—11月[29]。笔者推测造成1月组日本鳗鲡幼体肠道菌群丰度和多样性较高的原因，可能是1月组的日本鳗鲡幼体从产卵场到长江口的洄游过程中经历了高温的夏季至低温的冬季，而其他月份的日本鳗鲡幼体仅经历了温差相对较小的秋季至冬季或翌年春季。
3.2 长江口日本鳗鲡幼体肠道优势菌群变形菌门是多种鱼类肠道菌群的主要微生物类群[30]，尤其在鱼类早期生命阶段占比更高，如在养殖的梭鲈(Lucioperca Lucioperca)早期生命阶段占90%以上[31]，在大西洋鲑(Salmo salar)早期发育阶段也占主导地位[32]。但Bertucci等[33]发现欧洲鳗成体的肠道菌群中变形菌门约占37%，厚壁菌门约占30%，放线菌门约占16%；王悦等[34]发现花鳗(Anguilla marmorat)成体肠道菌群主要以梭杆菌门和厚壁菌门为主(占75%以上)；刘海姿等[15]发现美洲鳗白仔苗肠道菌群以厚壁菌门(约占83%)和变形菌门(约占11%)占优势。Zhu等[14]发现日本千叶山的日本鳗鲡成体肠道菌群主要以变形菌门(后肠占比37.24%，前肠占81.95%，平均55.37%)和拟杆菌门(前肠占比9.16%，后肠占比56.98%，平均36.36%)为主。本研究结果显示，变形菌门是长江口日本鳗鲡幼体肠道中第一优势菌群，8个样本中占比在61.10%~90.89%，平均占81.24%；占比较高的还有拟杆菌门10.61% (3.30%~38.69%)。这与许多鱼类及日本鳗鲡成体肠道菌群的研究结果接近，但与鳗鲡属其他种类差异明显。
有研究表明，草食性鱼类[武昌鱼(Megalobrama amblycephala)草鱼]的肠道中以纤维素降解菌——梭菌属(Clostridium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和纤毛菌属(Leptotrichia)为主；肉食性[鳜(Siniperca chuatsi)、欧白鱼(Alburnus alburnus)]以乳酸菌和蛋白酶产生菌——盐单胞菌属(Halomonas)为主，鲸杆菌属(Cetobacterium)也有较高比例；杂食性鱼类[鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)]主要以梭菌属、鲸杆菌属、盐单胞菌属为主[35]。但也有研究发现，自然生境中的草鱼肠道中主要为不动杆菌属(Acinetobacter)和贪铜菌属(Cupriavidus)[36]，养殖条件下的草鱼肠道中主要为鲸杆菌属和气单胞菌属(Aeromonas)[36-37]；野生肉食性鱼类(翘嘴鲌、达氏鲌和红鳍原鲌)肠道中以鲸杆菌属(26.30%)、邻单胞菌属(Plesiomonas) (21.02%)和气单胞菌属(15.46%)为主[25]；杂食性鱼类(鲤)肠道中主要为乳酸菌属(Lactobacillus Beijerinck)、气单胞菌属和邻单胞菌属(>85%)[38]。这表明尽管不同食性的鱼类其肠道菌群组成具有一定的规律性，但不同研究所得结果差异也很大。
Hsu等[39]发现东山江的日本鳗鲡成体肠道优势菌属主要为缓生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、鲸杆菌属、梭菌属和邻单胞菌属；Zhu等[14]发现日本千叶山的日本鳗鲡成体肠道中主要由鞘脂单胞菌科、黄杆菌属、红杆菌属组成。本研究发现长江口日本鳗鲡幼体肠道菌群主要为嗜冷杆菌属(35.10%)、假单胞菌属(16.75%)、黄杆菌属(7.99%)、无色杆菌属(4.82%)和希瓦氏菌属(4.21%)，这与其他鱼类的肠道微生物群落不同，也与日本鳗鲡成体的肠道菌群有很大差异。但肠道菌群中检测到了日本鳗鲡成体肠道所含的黄杆菌属和其他草食性鱼类所含不动杆菌属(占1.83%)和贪铜菌属(Cupriavidus)(占0.39%)，特别是黄杆菌属在样本AVA中为第一优势菌属，占比达38.32%。因此，笔者推测长江口日本鳗鲡幼体的食性以肉食性为主，也能消化一定的纤维素食物，这与我国河口鳗苗主要以浮游生物为食的研究结果相一致[40-41]。
3.3 日本鳗鲡幼体肠道菌群的功能分析通过PICRUSt软件对长江口野生日本鳗鲡幼体肠道菌群COG和KEGG功能注释预测发现，日本鳗鲡幼体肠道中与新陈代谢功能相关的菌群丰度最高，其中氨基酸转运与代谢、无机离子运输和代谢、脂质代谢和碳水化合物运输和代谢相关菌群占比较高。表明野生日本鳗鲡幼体肠道菌群对宿主营养代谢有一定的影响[42]，这与大多数鱼类肠道微生物功能组成的研究结果一致[43]。由此推测，日本鳗鲡幼体营养代谢过程中消化道内的氨氮浓度相对较高。目前，高碳水化合物和高脂肪含量的高成本效益饲料被广泛应用于水产养殖[44]。后续可针对营养代谢过程中日本鳗鲡幼体消化道中的核心菌群进行分离培养，并针对性地在鳗苗养殖过程中在饵料中加入相应的益生菌。
| [1] |
Tsukamoto K. Oceanic biology: Spawning of eels near a seamount[J]. Nature, 2006, 439(7079): 929..》Google Scholar
|
| [2] |
Tsukamoto K, Chow S, Otake T, et al. Oceanic spawning ecology of freshwater eels in the western North Pacific[J]. Nature Communications, 2011, 2: 179..》Google Scholar
|
| [3] |
Xie G. Survey and prospect of studies on artificial propagation and rearing eel (Anguilla japonica) fry: A review[J]. Journal of Dalian Fisheries University, 2001, 16(1): 42-48. [谢刚. 鳗鲡苗种人工繁育的研究概况及其展望[J]. 大连水产学院学报，2001, 16(1): 42-48.].》Google Scholar
|
| [4] |
Tanaka H. Progression in artificial seedling production of Japanese eel Anguilla japonica[J]. Fisheries Science, 2015, 81(1): 11-19..》Google Scholar
|
| [5] |
Guo H Y, Zhang X G, Zhang Y, et al. Effects of environmental variables on recruitment of Anguilla japonica glass eels in the Yangtze Estuary, China[J]. Fisheries Science, 2017, 83(3): 333-341..》Google Scholar
|
| [6] |
Wang S K, Song C, Zhang T T, et al. Spatiotemporal distribution and catching status of elver (Anguilla japonica) in the Yangtze River Estuary[J]. Journal of Fisheries of China, 2023, 47(2): 171-182. [王思凯，宋超，张婷婷，等. 长江口日本鳗鲡苗的时空分布与捕捞生产现状[J]. 水产学报，2023, 47(2): 171-182.].》Google Scholar
|
| [7] |
Xie Z L, Guo H Y, Tang W Q, et al. Age structure and growth characteristics at seaward migrating periods of Anguilla japonic a in the Yangtze River Estuary[J]. Journal of Fisheries of China, 2010, 34(2): 245-254. [谢正丽，郭弘艺，唐文乔，等. 长江口降海洄游鳗鲡的年龄结构与生长特征[J]. 水产学报，2010, 34(2): 245-254.].》Google Scholar
|
| [8] |
Guo H Y, Zhang Y, Tang W Q, et al. Pigmentation stages and body proportions of Anguilla japonica glass eels at the Yangtze River Estuary[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(1): 197-202. [郭弘艺，张亚，唐文乔，等. 长江口日本鳗鲡幼体色素发育时相及其体型变化[J]. 水生生物学报，2015, 39(1): 197-202.].》Google Scholar
|
| [9] |
Cahill M M. Bacterial flora of fishes: A review[J]. Microbial Ecology, 1990, 19(1): 21-41..》Google Scholar
|
| [10] |
Wang A R, Ran C, Ringø E, et al. Progress in fish gastrointestinal microbiota research[J]. Reviews in Aquaculture, 2018, 10(3): 626-640..》Google Scholar
|
| [11] |
Meng X L, Nie G X. Advances of intestinal microbiota and lipid metabolism of fish[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2019, 26(6): 1221-1229. [孟晓林，聂国兴. 鱼类肠道菌群与机体脂质代谢关系研究进展[J]. 中国水产科学，2019, 26(6): 1221-1229.].》Google Scholar
|
| [12] |
Talwar C, Nagar S, Lal R, et al. Fish gut microbiome: Current approaches and future perspectives[J]. Indian Journal of Microbiology, 2018, 58(4): 397-414..》Google Scholar
|
| [13] |
Meng X L, Li W J, Nie G X. Effect of different factors on the fish intestinal microbiota[J]. Journal of Fisheries of China, 2019, 43(1): 143-155. [孟晓林，李文均，聂国兴. 鱼类肠道菌群影响因子研究进展[J]. 水产学报，2019, 43(1): 143-155.].》Google Scholar
|
| [14] |
Zhu P, Wong M K S, Lin X, et al. Changes of the intestinal microbiota along the gut of Japanese Eel (Anguilla japonica)[J]. Letters in Applied Microbiology, 2021, 73(4): 529-541..》Google Scholar
|
| [15] |
Liu H Z, Liang Y, Zhai S W. Effect of different starter feeds on intestinal flora of Anguilla rostrata at elver stage[J]. Feed Research, 2021, 44(5): 51-55. [刘海姿，梁英，翟少伟. 不同开口饵料对美洲鳗鲡白仔苗肠道菌群的影响[J]. 饲料研究，2021, 44(5): 51-55.].》Google Scholar
|
| [16] |
Youssef N, Sheik C S, Krumholz L R, et al. Comparison of species richness estimates obtained using nearly complete fragments and simulated pyrosequencing-generated fragments in 16S rRNA gene-based environmental surveys[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(16): 5227-5236..》Google Scholar
|
| [17] |
Di Bella J M, Bao Y G, Gloor G B, et al. High throughput sequencing methods and analysis for microbiome research[J]. Journal of Microbiological Methods, 2013, 95(3): 401-414..》Google Scholar
|
| [18] |
Evariste L, Barret M, Mottier A, et al. Gut microbiota of aquatic organisms: A key endpoint for ecotoxicological studies[J]. Environmental Pollution, 2019, 248: 989-999..》Google Scholar
|
| [19] |
Wang X F, Zhao Y F, Song Z F, et al. Application of high- throughput sequencing techniques for analyzing bacterial communities in pond-raised mud crab (Scylla paramamosain) intestine and its aquaculture environment[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2017, 24(6): 1245-1253. [王贤丰，赵艳飞，宋志飞，等. 应用高通量测序技术分析拟穴青蟹肠道及其养殖环境菌群结构[J]. 中国水产科学，2017, 24(6): 1245-1253.].》Google Scholar
|
| [20] |
Chao A. Nonparametric estimation of the number of classes in a population[J]. Scandinavian Journal of Statistics, 1984, 11: 265-270..》Google Scholar
|
| [21] |
Simpson E H. Measurement of diversity[J]. Nature, 1949, 163(4148): 688..》Google Scholar
|
| [22] |
Shannon C E. The mathematical theory of communication[J]. Bell Labs Technical Journal, 1950, 3(9): 31-32..》Google Scholar
|
| [23] |
Lundin D, Severin I, Logue J B, et al. Which sequencing depth is sufficient to describe patterns in bacterial α- and β-diversity?[J]. Environmental Microbiology Reports, 2012, 4(3): 367-372..》Google Scholar
|
| [24] |
Huang L L, Zhang Y, Zhou H, et al. Comparison of intestinal microbial diversity in cold-water fishes in Xinjiang by 16S rRNA high-throughput sequencing[J]. Food Science, 2018, 39(10): 138-144. [黄丽丽，张艳，周红，等. 基于16S rRNA高通量测序方法比较新疆冷水鱼肠道中微生物多样性[J]. 食品科学，2018, 39(10): 138-144.].》Google Scholar
|
| [25] |
Xiao S S, Zhang A J, Liu J D, et al. Analysis on intestine microbial community structure of three carnivorous fishes in Qianxia Lake, China[J]. Chinese Journal of Fisheries, 2022, 35(3): 73-79. [肖善势，张爱菊，刘金殿，等. 千峡湖三种肉食性鱼类肠道微生物群落结构分析[J]. 水产学杂志，2022, 35(3): 73-79.].》Google Scholar
|
| [26] |
Wu S G, Wang G T, Angert E R, et al. Composition, diversity, and origin of the bacterial community in grass carp intestine[J]. PLoS One, 2012, 7(2): e30440..》Google Scholar
|
| [27] |
Ye S, Ma D Y, Zhai S W. Revealing the difference of intestinal microbiota composition of cultured european eels (Anguilla anguilla) with different growth rates[J]. Israeli Journal of Aquaculture - Bamidgeh, 2020, 72 (3): 1-12..》Google Scholar
|
| [28] |
Yukgehnaish K, Kumar P, Sivachandran P, et al. Gut microbiota metagenomics in aquaculture: Factors influencing gut microbiome and its physiological role in fish[J]. Reviews in Aquaculture, 2020: raq.12416..》Google Scholar
|
| [29] |
Zhang Y. Study on pigmentation developmental stages and morphological characteristics and otolith microchemistry of Japanese eels larvae, Anguilla japonica, collected in Yangtze River Estuary[D]. Shanghai: Shanghai Ocean University, 2013. [张亚. 长江口日本鳗鲡幼体的发育时相、形态特征和耳石化学研究[D]. 上海：上海海洋大学，2013.].》Google Scholar
|
| [30] |
Givens C E, Ransom B, Bano N, et al. Comparison of the gut microbiomes of 12 bony fish and 3 shark species[J]. Marine Ecology Progress Series, 2015, 518: 209-223..》Google Scholar
|
| [31] |
Dulski T, Zakęś Z, Ciesielski S. Characterization of the gut microbiota in early life stages of pikeperch Sander lucioperca[J]. Journal of Fish Biology, 2018, 92(1): 94-104..》Google Scholar
|
| [32] |
Gajardo K, Rodiles A, Kortner T M, et al. A high-resolution map of the gut microbiota in Atlantic salmon (Salmo salar): A basis for comparative gut microbial research[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 30893..》Google Scholar
|
| [33] |
Bertucci A, Hoede C, Dassié E, et al. Impact of environmental micropollutants and diet composition on the gut microbiota of wild European eels (Anguilla anguilla)[J]. Environmental Pollution, 2022, 314: 120207..》Google Scholar
|
| [34] |
Wang Y, Zhao P Y, Chen X H, et al. The comparative research on intestinal flora of Anguilla marmorata with different growth rates under intensive culture ponds condition[J]. Feed Industry, 2021, 42(4): 48-52. [王悦，赵盼月，陈学豪，等. 精养池模式下不同生长速度花鳗鲡的肠道菌群比较研究[J]. 饲料工业，2021, 42(4): 48-52.].》Google Scholar
|
| [35] |
Liu H, Guo X W, Gooneratne R, et al. The gut microbiome and degradation enzyme activity of wild freshwater fishes influenced by their trophic levels[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 24340..》Google Scholar
|
| [36] |
Wang C, Ni J J, Yan Q Y, et al. Comparison of the intestinal bacterial communities between grass carp (Ctenopharyngodon idellus) and bluntnose black bream (Megalobrama amblycephala)[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2014, 38(5): 868- 875. [王纯，倪加加，颜庆云，等. 草鱼与团头鲂肠道菌群结构比较分析[J]. 水生生物学报，2014, 38(5): 868-875.].》Google Scholar
|
| [37] |
Zhang H X, Tang H S, Zang Y, et al. Microorganism’s adaptation of crucian carp may closely relate to its living environments[J]. Microbiology Open, 2019, 8(3): e00650..》Google Scholar
|
| [38] |
Li J, Ni J, Li J, et al. Comparative study on gastrointestinal microbiota of eight fish species with different feeding habits[J]. Journal of Applied Microbiology, 2014, 117(6): 1750-1760..》Google Scholar
|
| [39] |
Hsu H Y, Chang F C, Wang Y B, et al. Revealing the compositions of the intestinal microbiota of three Anguillid eel species using 16S rDNA sequencing[J]. Aquaculture Research, 2018, 49(7): 2404-2415..》Google Scholar
|
| [40] |
Liu Y X, Xie Y H, Li B, et al. Preliminary study on the feeding habit of the upstream migratory elver of Japanese eel (Anguilla japonica) in the estuary of northern Yellow Sea, China[J]. Fisheries Science, 1992, 11(2): 4-7. [刘义新，解玉浩，李勃，等. 辽东半岛(黄海北部)溯河鳗苗食性的初步研究[J]. 水产科学，1992, 11(2): 4-7.].》Google Scholar
|
| [41] |
Fu L J, Li B, Liu Y X. Preliminary study on feeding habits of eel fry in coastal estuaries of China[J]. Reservoir Fisheries, 1993, 14(4): 16-17. [富丽静，李勃，刘义新. 中国沿海河口地区鳗苗食性的初步研究[J]. 水利渔业，1993, 14(4): 16-17.].》Google Scholar
|
| [42] |
Lyons P P, Turnbull J F, Dawson K A, et al. Phylogenetic and functional characterization of the distal intestinal microbiome of rainbow trout Oncorhynchus mykiss from both farm and aquarium settings[J]. Journal of Applied Microbiology, 2017, 122(2): 347-363..》Google Scholar
|
| [43] |
Luo M K, An R, Fu J J, et al. Comparative analysis of the gut microbiota in bighead carp under different culture patterns[J]. Journal of Applied Microbiology, 2022, 132(2): 1357-1369..》Google Scholar
|
| [44] |
Xie D Z, Yang L P, Yu R M, et al. Effects of dietary carbohydrate and lipid levels on growth and hepatic lipid deposition of juvenile tilapia, Oreochromis niloticus[J]. Aquaculture, 2017, 479: 696-703..》Google Scholar
|