黑鲫(Carassius carassius)属鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲫属(Carassius)^[1]，在世界上自然分布于中欧、东欧及亚洲西部^[2-3]，在我国仅分布于新疆地区额尔齐斯河流域^[3]。黑鲫多生活于水草丛生的湖泊、湿地、河汊等缓水或静水水域中，具有耐低温、耐低氧的生物学特征^[1-2]，是额尔齐斯河鱼类区系组成中重要的土著物种^[4]，在鱼类抗寒、耐低氧品种培育中也具有重要的科学利用价值。

额尔齐斯河流域处于干旱地区^[5]，受其特殊气候的影响^[6]，其河流、湖泊、湿地等生态环境非常脆弱^[7]，同时由于过度捕捞^[8]、水电工程建设^[9]、农田用水^[10]等环境变化及人类活动的影响，黑鲫自然栖息范围严重缩减，资源数量明显衰退^[3-4]，目前仅在少数泡沼、湿地等水域中生存，已于2022年列入新疆维吾尔自治区野生动物I级保护名录^[11]，因此急需开展黑鲫种群资源的保护研究。

鱼卵胚胎、仔稚鱼的发育阶段是鱼类的早期生活史阶段，是由受精卵发育成健康个体的重要生命过程^[8]。鱼类胚胎发育期间受环境影响较大，其中温度是影响胚胎的重要的环境因子之一，对冷水性鱼类^[12-15]温水性鱼类^[16-18]等及热带鱼类^[19-21]等的研究表明，不同繁殖习性鱼类的产卵、胚胎孵化都需要适宜水温，因此了解胚胎及仔鱼发育特征是鱼类资源保护和利用的重要基础^[22]。在自然环境下，黑鲫产卵期为5—6月^[3]，由于额尔齐斯河流域气温日差较大^[23]，水体的温度会有明显的波动，可能会影响黑鲫鱼的产卵活动及胚胎的正常发育；此外，黑鲫一般栖息于池塘、泡沼等浅水水域，受新疆地区极端气候的影响^[6]，这些小型水域容易干旱缺水而干涸，产卵场受到破坏而威胁到后代资源，黑鲫的繁殖及生存面临着恶劣的环境条件，因此了解黑鲫的繁殖环境条件及胚胎、仔稚鱼早期资源的发育特征对保护其野生资源很有必要。

在鲫属鱼类中关于鲫(Carassius auratus)^[24-25]、银鲫(Carassius auratus gibelio)^[25-26]等的胚胎发育研究已有报道，而黑鲫的人工繁育方面还缺乏数据资料，本研究在额尔齐斯河水域收集黑鲫亲本，通过人工催产受精的方式获得受精卵，对其早期发育特征进行观察，了解胚胎及仔鱼发育特点及规律，丰富其繁殖生物学数据，为黑鲫的人工繁育及种群资源保护利用提供理论依据。

本实验于2021年5月下旬开始在新疆额尔齐斯河布尔津河江段一处泡沼中通过地笼收集黑鲫，其中个体较小的黑鲫放回水中，只保留个体较大、健康无伤的亲鱼，将所捕获的黑鲫使用高锰酸钾溶消毒后暂养于“布尔津额河特有冷水鱼开发有限公司”提供的水泥池塘中。

性腺发育良好的雌鱼腹部膨大且柔软，生殖孔扩大且红润，雄鱼头部布满珠星，轻压腹部有乳白色精液流出。从中挑选出性腺成熟状况良好、身体健康无伤的亲鱼分开暂养。此次所选亲鱼共26尾，雌鱼18尾，雄鱼8尾。雌性体重(125.35±41.87) g，体长(147.79±23.37) mm；雄鱼体重(101.77±35.74) g，体长(142.00±20.04) mm。

使用适量催产药剂对所选亲本进行催产，使其更好排卵，从而保证受精卵的质量。此次催产药剂按体质量注射不同剂量，雌鱼所使用催产药物为潘多立酮(1 mg/kg), LHRH- A₂ (5 μg/kg)，使用0.9%氯化钠溶液稀释后由胸鳍基部凹陷处进行注射，雄鱼剂量减半。注射催产药剂后将雌雄亲本分开暂养。

在注射催产剂24 h后，每隔4 h进行观察，若轻压腹部可以流出卵粒分明、透亮的卵粒和乳白色精液，则可以进行人工授精。黑鲫采用干法受精，将雌鱼捞出用干毛巾擦干体侧水分，轻压腹部使卵子流入准备好的盆中，后以同样的方法将精液挤入盆中，迅速加入生理盐水使用羽毛搅拌约5 min，使其充分受精。加入清水对受精卵进行轻微搅拌清洗，最后加入适量清水使其充分吸水膨胀。

授精完成后将受精卵置于微流水的孵化槽中，放入氧泵保证其氧含量充足，溶解氧保持在7 mg/L以上，温度在(19.89±0.64) ℃。同时及时清除孵化框中的发霉死卵，防止发霉死卵黏附于正常受精卵之上使其缺氧死亡。

通过参考同属鱼类胚胎发育文献成果^[24-26]，了解黑鲫胚胎发育过程及其不同时期主要特征。使用温度计HOBO Water Temp Pro v2记录温度，设定每10 min读取一次温度，用于胚胎孵化所需积温的计算。通过Leica S6D显微镜观察，拍摄记录胚胎发育各个时期照片，记录对应时间。观察时，受精卵发育至4细胞期前，间隔10~15 min取一定数量受精卵观察拍摄，发育至囊胚期前，间隔20~30 min取一次并观察，发育至神经胚期，间隔30~60 min取一次并观察，之后至出膜间隔2~3 h取一次，期间，根据实际情况调整下次观察时间。每次随机抽取不少于30粒的受精卵进行观察，以超过抽取卵数的60%为标准判定进入下一发育时期。积温(h·℃)为某时期温度平均值(℃)与时间的乘积(h)。

利用Excel2019处理温度和时间数据，Photoshop2019进行图片的制作。

黑鲫发育成熟的卵呈圆形，淡黄色，无油球，平均卵径为(1.03±0.14) mm。受精卵透明，为沉性卵，微黏性，吸水膨胀后平均卵径为(1.6±0.08) mm。未成功受精的卵也可以吸收膨胀并形成假胚盘，但随着时间推移，未受精的卵逐渐由透明状变浑浊，最终发白死亡浮在水面之上。本次实验中，共采集鱼卵5000粒，受精率为92.58%，孵化成功率为89.92%。

黑鲫胚胎从受精卵至出膜历时110 h 35 min，全程水温18.84~21.91 ℃，平均水温(19.89±0.64) ℃，总积温2274.54 h·℃，胚胎发育过程分为7个阶段26个时期，发育阶段包括受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官形成和出膜共计7个阶段(表1、图1)。

表1

表1 　黑鲫胚胎发育及特征 Tab. 1 　Features of embryonic development of Carassius carassius 发育阶段 development stage 发育时期 embryonic development period 受精后时间 time after fertilization 各发育期特征 average water temperature 图序(图1) figure ordinal (fig.1) 受精卵 fertilized eggs 受精卵 fertilized eggs 0 圆球状、黏性、亮黄色 a 卵周隙形成 perivitelline space formation 30 min 受精卵内原生质向动物极聚集，形成周隙 b 卵裂 cleavage 胚盘隆起 blastodisc stage 50 min 原生质向动物极集中而形成隆起的胚盘 c 2细胞期 2-cell stage 1 h 10 min 胚盘分裂成2个分裂球 d 4细胞期 4-cell stage 2 h 分裂沟于第1次垂直，形成4个分裂球 e 8细胞期 8-cell stage 2 h 35 min 继续分裂为8个分裂球 f 16细胞期 16-cell stage 2 h 50 min 继续分裂为16个分裂球 g 32细胞期 32-cell stage 3 h 10 min 继续分裂为32个分裂球 h 多细胞期 multi-cell stage 5 h 10 min 多次分裂后形成细胞团，细胞间隙尚且可见 i 囊胚 blastula 囊胚早期 early blastula stage 6 h 40 min 分裂球越来越小且间隙模糊，分裂球形成囊胚层，胚盘高举于卵黄上 j 囊胚中期 mid-blastula stage 12 h 10 min 间隙消失不可见，囊胚层开始变扁下包，与卵黄初成球形 k 囊胚晚期 late blastula stage 16 h 30 min 囊胚层继续下包，下包约1/3卵黄处 l 原肠胚 gastrula 原肠早期 early gastrula stage 17 h 20 min 胚层继续下包，下包至约1/2处 m 原肠中期 mid-gastrula stage 23 h 10 min 胚层继续下包至2/3处 n 原肠晚期 late gastrula stage 24 h 30 min 胚层继续下包至3/4, o 神经胚 neural 神经胚期 neural stage 26 h 20 min 胚层继续下包，胚体开始隆起，出现神经板雏形 p 胚孔封闭器 blastopore closing 28 h 10 min 下包形成胚孔，胚孔越来越小至封闭完全 q 器官形成 organ formation 肌节出现期 sarcomere stage 37 h 20 min 肌节出现，肌节位于胚体中段，胚体两端大小不一，头部微大 r 眼基期 eye bud appearance 39 h 40 min 头端前段两侧出现肾性隆起 s 眼囊期 eye sac appearance 44 h 15 min 眼部发育至长椭圆形，胚体首尾最为接近 t 尾芽期 caudal bud appearance 51 h 5 min 眼部开始变圆，尾部轻微抬起 u 晶体出现期 eye lens formation 60 h 55 min 眼杯中出现晶体，头部发育分化较明显 v 耳石期 otolith formation 65 h 15 min 脑后方出现圆形晶体，胚体开始出现轻微扭动 w 心跳期 heart beating 70 h 35 min 胚体头部下方出现心脏，开始轻微且无规律搏动 x 出膜前期 hatching prophase 73 h 35 min 眼部发黑，身体扭动频率与幅度增大，心跳加快，身体发育完善 y 出膜 hatching 出膜期 hatching 110 h 35 min 鱼体出现色素沉淀，头部与尾部不断与卵膜发生碰撞直至出膜 z

表1 　黑鲫胚胎发育及特征 Tab. 1 　Features of embryonic development of Carassius carassius

图1

图1 　黑鲫胚胎和胚后发育a. 受精卵；b. 卵周隙形成. c. 胚盘隆起. d. 2细胞期. e. 4细胞期. f. 8细胞期. g. 16细胞期. h. 32细胞期. i. 多细胞期. j. 囊胚早期. k. 囊胚中期. l. 囊胚晚期. m. 原肠早期. n. 原肠中期. o. 原肠晚期. p. 神经胚期. q. 胚孔封闭期. r. 肌节出现期，箭头示肌节. s. 眼基期. t. 眼囊期. u. 尾芽期，箭头示尾芽. v. 晶体出现期，箭头示晶体. w. 耳石期，箭头示耳石. x. 心跳期，箭头示心脏原基. y. 出膜前期. z. 初孵仔鱼. aa. 1日龄仔鱼. bb. 2日龄仔鱼. cc. 3日龄仔鱼. 比例尺：0.3 mm. Fig. 1 　Development of embryo and larva of Carassius carassiusa. Fertilized eggs. b. Perivitelline space formation. c. Blastodisc stage. d. 2-cell stage. e. 4-cell stage. f. 8-cell stage. g. 16-cell stage. h. 32-cell stage. i. Multi-cell stage. j. Early blastula stage. k. Mid-blastula stage. l. Late blastula stage. m. Early gastrula stage. n. Mid-gastrula stage. o. Late gastrula stage. p. Neural stage. q. Blastopore closing. r. Sarcomere stage, arrowhead shows the myomere. s. Eye bud appearance. t. Eye sac appearance. u. Caudal bud appearance, arrowhead shows the tail bud. v. Eye lens formation, arrowhead shows the crystal. w. Otolith formation, arrowhead shows the otolith. x. Heart beating, arrowhead shows the heart rudiment. y. Hatching prophase. z. First hatchlings. aa. 1-day-old larvae. bb. 2-day-old larvae. cc. 3-day-old larvae. Scale bar: 0.3 mm.

黑鲫受精卵与成熟的卵相似，呈圆球状、微黏性、亮黄色(图1a)；受精后30 min卵周隙明显，可初步辨别是否受精(图1b)。该阶段总积温9.758 h·℃。

受精后50 min，原生质向动物极集中而形成隆起的胚盘(图1c)；受精后1 h 10 min出现第1次卵裂，胚盘分裂成2个分裂球，进入2细胞期(图1d)；受精后2 h第2次分裂，分裂沟于第1次垂直，进入4细胞期(图1e); 2 h 35 min后第3次分裂，出现8个大小接近的分裂球，进入8细胞期(图1f); 2 h 50 min第4次分裂，分裂为4×4排列的16个分裂球，进入16细胞期(图1g); 3 h 10 min后第5次分裂，分裂为32个分裂球，其散乱分布大小不一，此时细胞球基本处于同一层，进入32细胞期(图1h)。受精后5 h 10 min，经过多次分裂，分裂球变小且细胞间隙尚且可见，形成多细胞胚体，此时进入多细胞期(图1i)。该阶段总积温92.776 h·℃。

受精后6 h 40 min，随卵裂次数增加，分裂球越来越小且间隙模糊，分裂球形成囊胚层，胚盘高举于卵黄上，进入囊胚早期(图1j)；受精后12 h 10 min，间隙消失不可见，囊胚层开始变扁下包，与卵黄初成球形，进入囊胚中期(图1k)；受精后16 h 30 min，囊胚层继续下包，下包约1/3卵黄处，此时进入囊胚晚期(图1l)。该阶段总积温223.885 h·℃。

受精后17 h 20 min，囊胚层继续下包，下包至约1/2处，此时胚层下包边缘开始变厚，胚环出现，进入原肠早期(图1m)；受精后23 h 10 min，胚层下包至2/3处，进入原肠中期(图1n)；受精后24 h 30 min，胚层下包至3/4，进入囊胚晚期(图1o)。总积温156.705 h·℃。

受精后26 h 20 min，胚层继续下包，胚体开始隆起，出现神经板雏形，进入神经胚期(图1p)；受精后28 h 10 min，下包形成胚孔，胚孔越来越小至封闭完全，此时进入胚孔封闭期(图1q)。该阶段总积温72.285 h·℃。

受精后37 h 20 min，肌节出现，肌节位于胚体中段，此时胚体两端出现大小不一，头端微大，进入肌节出现期(图1r)。受精后39 h 40 min，头端前段两侧出现肾性隆起，肌节数目增加，进入眼基期(图1s)；受精后44 h 15 min，眼部发育至长椭圆形，肌节数目进一步增加，胚体未出现尾部抬起，该时期胚体环绕卵黄最多，首尾最为接近，进入眼囊期(图1t)；受精后51 h 5 min，胚体尾部出现抬起状态，同时眼部开始变圆，进入尾芽期(图1u)；受精后60 h 55 min，眼杯中出现晶体，头部发育分化较明显，进入晶体出现期(图1v)；受精后65 h 15 min，脑后方出现圆形晶体，此时胚体开始出现轻微扭动，进入耳石期(图1w)；受精后70 h 35 min，胚体头部下方出现心脏，并开始轻微且无规律搏动，进入心跳期(图1x)；受精后73 h 35 min，胚体发育较为完善，眼部发黑，身体扭动频率与幅度增大，心跳加快(112次/min)且规律，出现少量色素沉淀，此时进入出膜前期(图1y)。该阶段总积温908.432 h·℃。

受精后110 h 35 min，体加快扭动，头部与尾部不断与卵膜发生碰撞，溶膜酶作用下顶破后完成出膜，头部与尾部均可先出膜，同时该阶段鱼体出现色素沉淀，刚出膜鱼体向背部弯曲(图1z)。该阶段总积温810.670 h·℃。

刚破膜1 d的仔鱼鱼苗全长(4.45±0.12) mm，仔鱼呈淡黄色，前段膨大，卵黄饱满尚未吸收，胚体发育不完善，静卧于水底(图1aa) (5.13±0.18) mm; 2 d后卵黄变小，色素沉淀增加，刺激后出现短暂急促游动，身体弯曲程度减小，接近笔直，体长增加，全长(5.13±0.18) mm(图1bb); 3 d后对外界刺激更为敏感，活力增加，体长进一步增加，此时卵黄几乎消失，大多仔鱼开口，但由于游动能力较差，捕食效率低，此时仍生长较慢，臀鳍与尾鳍清晰可见，全长(5.69±0.17) mm (图1cc)。

黑鲫受精卵为典型的端黄卵，卵裂类型为盘状卵裂，与大多数淡水鱼类相同。本研究在人工繁育的条件下，记录了黑鲫胚胎发育的7个阶段26个时期的形态特征变化，基本遵循“卵裂–胚体形成–器官分化–孵化出膜”的顺序。对比其他鲫属鱼类的胚胎发育分期略有不同，例如，胡菊^[24]将淇河鲫(Carassius auratus in Qihe river)分为7阶段23时期，马海艳等^[25]将银鲫和普通鲫胚胎发育分为6阶段25个时期，梁正其等^[26]将普安银鲫(Carassius auratus)胚胎发育分为6阶段23时期. 此外，对比额尔齐斯河其他土著鱼类的胚胎发育分期也存在较大不同，例如杜劲松等^[27]将白斑狗鱼(Escox lucius)胚胎发育划分为6个阶段33个时期，黄金善等^[28]将梭鲈(Sander lucioperca)划分为6阶段24个时期，而乔德亮等^[29]将河鲈(Perca fluvitills)仅划分为16个时期。该结果证明影响鱼类胚胎发育过程的因素并不是单一的，而是自身遗传特征和外部环境共同作用的结果，因此即使是遗传关系较为亲近的同属鱼类因为外部环境的不同胚胎发育过程也会产生差异，同样地，处于相同环境下的鱼类也会因为自身遗传特性的差异导致其胚胎发育过程产生较大差异。另外，黑鲫与其它鱼类胚胎发育相比较，神经胚阶段之前发育过程相同，进入器官发育阶段后出现差异。相较于白斑狗鱼和黑斑原鮡(Glyptosternum maculatum)^[30]，耳石期与心跳期先后顺序不同；黑鲫出现明显扭动(肌肉效应期)和心跳出现时间相隔较长，而多纹蝶鱼(Selenotoca multifasciata)^[19]则先出现心跳与黑鲫相反，且出现该特征时间接近。

黑鲫与同属鱼类胚胎发育水温、积温等指标对比如表2所示。结果显示，相较于胚胎发育水温接近的普安银鲫和发育水温较高的银鲫、鲫和淇河鲫，黑鲫所需的孵化时间和积温均更高，表明黑鲫具有自身独特的遗传特性和对生存环境的适应性。另外与额尔齐斯河部分土著鱼类相比，黑鲫胚胎发育所需积温略低于白斑狗鱼^[27]和河鲈^[29]，在对黑鲫天然产卵场调查时发现，黑鲫繁殖期晚于两种鱼类，此时生存水域水温升高，因此黑鲫能够更快地完成胚胎发育过程，这可以看作是黑鲫为了弥补繁殖期较晚的一种适应性繁殖策略。

表2

表2 　鱼类胚胎发育积温对比 Tab. 2 　Comparison of accumulated temperature of fish embryonic development 物种名称species name 水温/℃water temperature 总时长/htotal duration 积温/h·℃accumulated temperature 数据来源data socrrce 黑鲫Carassius carassius 19.89±0.64 110.58 2274.538 本研究 普安银鲫Carassius auratus 18.00 98.71 1776.78 [24] 银鲫Carassius auratus gibelio 23.00±1.00 59.31 1364.13 [23] 鲫Carassius auratus 23.00±1.00 59.05 1358.15 [23] 淇河鲫Carassius auratus Qihe river 23.00~25.00 58 1439.57 [22] 白斑狗鱼Escox lucius 5—11 185.3 2641.37 [25] 河鲈Perca fluvitills 8—13 265 2540—2880 [27]

表2 　鱼类胚胎发育积温对比 Tab. 2 　Comparison of accumulated temperature of fish embryonic development

目前对于鱼类早期发育时期的划分尚未明确，通常分为胚胎、仔鱼、稚鱼3个阶段^[15]，对于仔稚鱼的划分则一般按照卵黄囊的吸收、鳞片的形成等特征^[21]，其中仔鱼阶段是指鱼苗孵出到鳞片的出现，而仔鱼阶段又可以依据卵黄囊的吸收程度分为早期仔鱼和晚期仔鱼。本研究中将黑鲫孵化出膜至卵黄囊被完全吸收定为早期仔鱼。研究发现，黑鲫早期仔鱼发育阶段时间较短，仅3 d卵黄囊便被完全吸收，这时仔鱼行动灵敏，对外界刺激反应强烈，证明此时的黑鲫仔鱼活性较高，具备了独立生存的能力，同时意味着黑鲫仔鱼由内源性和外源性营养混合吸收的方式转变为外源性营养吸收的方式。

鱼类的胚胎发育和孵化水温密切相关，是胚胎发育的重要影响因子之一，适宜的孵化水温是鱼类胚胎正常发育的基本条件，在适温范围内，水温越高，其孵化速率越快^[31]。例如普安银鲫在18 ℃水温下需要98.71 h完成孵化，在24 ℃水温下需要56.48 h完成孵化，而在26 ℃水温下仅需要28.20 h完成孵化。另外，孵化水温接近的银鲫、鲫和淇河鲫其孵化时长也存在差异，这可能与本身的生长特性以及初温度外的其他孵化条件密切相关。有研究表明，温度的升高能加快胚胎的新陈代谢从而提高孵化速率^[32-33]，但温度过高可能造成胚胎发育畸形。因此，温度对黑鲫胚胎发育的影响有待进一步探究。

野外捕捞亲鱼时发现，将亲鱼由地笼转移至鱼箱时受到刺激的黑鲫会排出晶莹剔透的卵粒，证明此时少量黑鲫亲鱼性腺已发育至成熟，具备繁殖条件，同时测量水温发现可达12 ℃左右，随着时间的推移，水温持续上升，当温度超过15 ℃时，可发现黏附于芦苇根茎上的受精卵，证明多数黑鲫已经开始繁殖。随水温上升的产卵行为本质是变温刺激排卵^[34]，推测低温限制黑鲫排卵。结合野外采捕亲鱼及人工繁殖实验发现黑鲫自然繁殖时期在5月下旬至6月中旬，较额尔齐斯河其他鱼类相比，白斑狗鱼4月初开始产卵，河鲈和梭鲈等5月初开始产卵，由此可见在长期的自然选择过程中，黑鲫根据自身繁殖特点结合当地的温度变化情况形成了最适合自身的繁殖时期，从而提高其后代成活率。

额尔齐斯河流域黑鲫的种群资源已出现明显衰退，针对当前黑鲫种群状况，建议渔业管理部门严格管控捕捞网具和违法捕鱼行为，加大对非法捕捞的打击力度，制定科学的渔业开发策略；在黑鲫繁殖时期设置禁渔期，严禁捕捞活动，选择优质的亲本进行人工繁育，增加放流力度，对黑鲫的野生资源量进行补充；减少农业灌溉、挖沙采矿等人类活动，保证其种群的生存环境；同时加强黑鲫繁殖生物学和种群动态方面的研究，在现有的黑鲫胚胎及早期仔鱼的研究基础上对后期仔鱼和稚鱼进一步深入研究，摸清黑鲫仔稚鱼生长特性、食性等个体生物学，为黑鲫的人工繁育、苗种培育和增殖放流提供理论指导，以促进黑鲫野生资源量的恢复。